[发明专利]一种Plipastatin衍生环五脂肽及其产生菌和应用

权利要求书

1.一种产抗菌物质的枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ） Best2，其特征在于通过同源重组的方法靶向缺失保藏号为CGMCC No.11723的枯草芽孢杆菌pB2-L基因组中的ppsC和ppsD基因，获得缺失ppsC和ppsD基因产抗菌物质的枯草芽孢杆菌Best2。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Best2，其特征在于通过以下方法构建：

(1)构建缺失ppsC和ppsD基因的敲除质粒pKS-CD：

a.根据NCBI数据库设计如下引物：

P1：SEQ ID NO.1，P2：SEQ ID NO.2，P3：SEQ ID NO.3，P4：SEQ ID NO.4；

b.以B.subtilis pB2-L基因组为模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分别扩增上下游片段，再以上、下游片段为模板，在反应体系中加入P1、P4进行融合PCR反应，获得敲除基因片段CD；

c.用限制性内切酶对敲除基因片段CD和质粒pKS2进行酶切，并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒pKS2获得pKS-CD；

(2)重组质粒pKS-CD转化保藏号为CGMCC No.11723的枯草芽孢杆菌pB2-L感受态细胞，获得含有敲除质粒pKS-CD的枯草芽孢杆菌；

(3)缺失了ppsC和ppsD基因的敲除菌株的筛选和鉴定：用经转化的含敲除质粒pKS-CD的枯草芽孢杆菌进行37℃温度诱导重组，筛选出LB固体培养基平板上红霉素敏感的单菌落，提取其基因组，运用PCR方法验证敲除基因片段，并通过测序进一步确认为敲除菌株，该敲除菌株即为所述的产抗菌物质的枯草芽孢杆菌Best2。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Best2在制备抗菌物质中的应用；所述的抗菌物质包括分子量为875.55、889.56和903.58的3种组分。

4.一种利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Best2制备抗菌物质的方法，其特征在于包含在改良的Landy培养基中对枯草芽孢杆菌Best2进行发酵，获得含Plipastatin衍生环五脂肽的发酵液，对发酵液进行分离纯化，获得含抗菌物质粗提物；其中，所述的改良的Landy培养基组分40.0g·L^-1葡萄糖，14.0g·L^-1L-谷氨酸钠，2.3g·L^-1(NH₄)₂SO₄，1.0g·L^-1K₂HPO₄，0.5g·L^-1MgSO₄，0.5g·L^-1KCl，1.6mg·L^-1CuSO₄，1.2mg·L^-1Fe₂(SO₄)₃，0.4mg·L^-1MnSO4，100mM 3-N-玛啡啉丙磺酸构成的，pH 7.0～7.2。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包含以下步骤：

a.将枯草芽孢杆菌Best2进行培养，得到抗菌物质发酵液；

b.抗菌物质发酵液离心，收集上清液，酸沉，将沉淀进行甲醇抽提，得抗菌提取物；

c.抗菌提取物通过LC-ESI-MS/MS分离鉴定抗菌物质。