[发明专利]一种酶法再生ATP的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种酶法再生ATP的方法。

背景技术

ATP是生物体内最重要的高能磷酸化合物，在医学上被广泛用作肌肉萎缩、心肌梗塞、肝炎和各种急救病症中的治疗或重要辅助治疗药物。工业上也有许多重要的生物活性物质或生化药物的生物合成过程，也都是需要ATP参加的酶促反应。所以，ATP的生产以及工业上ATP的循环再生成为酶工程发展的一个重要问题，是决定工业生产是否经济节约的关键因素。

近年来，对ATP再生的研究主要在多聚磷酸激酶催化法，即以ADP和多聚磷酸为底物，由多聚磷酸激酶催化产生ATP。对于不同来源的多聚磷酸激酶，催化特点各不相同。如Thermotogamaritima来源的多聚磷酸激酶TePpk是一种嗜热酶，它的最适温度为70度，适合参与温度较高的反应，但在多数常温酶的最适温度(30～37度)条件下酶活较低，不能与常温酶的耦合反应，因此不能广泛的满足工业生产需求。还有一些多聚磷酸激酶，虽然最适温度在30度左右，但是利用的多聚磷酸盐聚合度较高，这种聚合度高的聚磷酸盐在当前在市场上不易得到而且价格昂，这就提高了生产难度和生产成本。另一方面，就工业大量生产ATP而言，一些多聚磷酸激酶会受到多聚磷酸盐的抑制，所以大规模生产时不得不采用流加多聚磷酸盐的方法来减少抑制，使生产过程变得繁琐。所以现在亟需找到一种合适的多聚磷酸激酶，使它既能与许多常温酶耦合参与工业生产，又能够使用比较常见且价格低廉的多聚磷酸盐为磷酸供体，使ATP再生过程方便、廉价、高效。

与公知技术相比，本发明具有以下优点：

1)反应最适温度为30～37度，符合工业生产上多数常温酶的温度要求，应用范围广泛。

2)磷酸供体为低聚合度的多聚磷酸盐，相比聚合度为65或者更高聚合度的多聚磷酸盐，这些低聚合度的多磷酸盐价格低廉且常见易得，使ATP再生过程经济、方便。

3)没有聚磷酸盐抑制现象，能在较高浓度的多聚磷酸底物作用下高效生产ATP。

发明内容

本发明的目的在于提供一种异源表达的聚磷酸激酶，以低聚合度的多聚磷酸盐为磷酸供体，在聚磷酸激酶的催化条件下生成ATP，为多种消耗ATP的酶促反应源源不断的提供能量。

本发明首先构建基因工程菌，异源表达来自谷氨酸棒状杆菌的多聚磷酸激酶基因。即将基因ppk克隆至原核表达载体pET28a中得到多聚磷酸激酶基因表达载体pET28a-ppk。然后将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，即可在胞内获得多聚磷酸激酶。

蛋白表达后，通过超声破碎将大肠杆菌中的多聚磷酸激酶释放出来，获得粗酶液。在三聚磷酸、四聚磷酸或者六偏磷酸或其钠盐为磷酸供体的条件下，以ADP为底物粗酶液催化产生ATP。

本发明提供的方法，以ADP为底物，利用价格低廉的三聚磷酸、四聚磷酸和六偏磷酸为磷酸供体，异源表达多聚磷酸激酶催化产生ATP，为经济高效生产ATP并在此基础上降低多种酶促反应的成本提供了一种创造性的方法。

图1：DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧为多聚磷酸激酶基因ppk的PCR产物，右侧为DNA大小标准品。

图2：pET28a-ppk质粒图谱，将ppk基因克隆到pET28a载体上，基因的两端有NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点。

图3：诱导表达多聚磷酸激酶PPK蛋白电泳图。泳道1为pET28a空质粒表达后破胞上清，泳道2为PPK酶表达后破胞上清。

图4：谷氨酸棒状杆菌来源的多聚磷酸激酶动力学参数曲线

图5：嗜热链球菌来源的谷胱甘肽合成双功能酶以PPK催化生成的ATP为能源酶促产生谷胱甘肽的反应体系。30mM反应体系中分别添加5mM、10mM、15mM、20mM、30mMATP时，各时段的转化率对比。“10hGS”为30mM反应体系中只加入了GS酶，仅靠外源添加的ATP提供能量，反应10h后取样检测得到的转化率。“22hGS”为30mM反应体系中只加入了GS酶，仅靠外源添加的ATP提供能量，反应22h后取样检测得到的转化率。“10hGS+PPK”为30mM反应体系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶重生的ATP提供能量，并在反应10h后取样检测的转化率。“22hGS+PPK”为30mM反应体系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶再生的ATP提供能量，并在反应22h后取样检测的转化率。

图6：酶促反应生成3-磷酸甘油的实验组和对照组的反应进程对比