[发明专利]表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢，该重组芽孢融合表达枯草芽孢杆菌的锚定蛋白CotG与谷氨酸脱氢酶GDH2，所述的锚定蛋白CotG，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的谷氨酸脱氢酶GDH2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了该重组芽孢在制备L‑2‑氨基丁酸中的应用，重组芽孢上锚定的谷氨酸脱氢酶蛋白发挥全细胞催化剂功能，以α‑酮丁酸为底物，催化生产L‑2‑氨基丁酸，发酵液中L‑2‑氨基丁酸的浓度可达38.72g/L，转化率为95.6％。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢及其构建方法与应用。

背景技术

L-2-氨基丁酸是一种抑制人体神经信息传递的非天然氨基酸，具有加强葡萄糖磷酸酯酶的活性，促进脑细胞代谢的作用。同时，L-2-氨基丁酸也是一种重要的化工原料和很多药物合成的手性中间体，已被广泛用于药物合成，例如，它是抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦的关键生产原料，也是抑菌抗结核药乙胺丁醇盐酸盐的关键手性前体。因此，大量生产L-2-氨基丁酸可以降低这些疾病治疗的成本，同时提高其高效性和安全性。根据文献报道，经过定点突变K92V和T195S的新型谷氨酸脱氢酶能在辅因子NADPH的存在下作用于产L-2-氨基丁酸的代谢过程。

芽孢表面展示技术是新近发展起来的一门基因操作技术。芽孢是枯草芽孢杆菌在营养缺乏等逆境条件下，营养细胞分化形成的休眠体。由于芽孢的特殊结构，使其能忍耐一些极端环境如高温、高压、化学药物等。实现芽孢表面展示技术的关键是需要一种高丰富度、表面结合能力强的芽孢衣壳蛋白。外层的芽胞衣壳主要由疏水的衣壳蛋白构成，具有抗酶解、抗药物功能。目前已报道被成功应用的芽孢衣壳蛋白如CotB、CotC、CotG和CotX，都是来源于外层。从现有的文献报道来看，CotB和CotC常用于锚定抗原制备疫苗，而CotG则锚定酶蛋白发挥全细胞催化剂功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢在产L-2-氨基丁酸中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢，其特征在于，该重组芽孢导入了表达枯草芽孢杆菌的锚定蛋白CotG基因与谷氨酸脱氢酶GDH2基因，

所述的锚定蛋白CotG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的谷氨酸脱氢酶GDH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，锚定蛋白CotG基因的N端为CotG基因的启动子，所述的CotG基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

其中，锚定蛋白CotG基因与谷氨酸脱氢酶GDH2基因之间的连接区域的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

上述表面展示谷氨酸脱氢酶的重组芽孢的构建方法，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列依次连接，得到整合片段CotG-gdhA；

(2)将整合片段CotG-gdhA克隆到pEB03质粒的多克隆位点处，得到重组质粒pEB03-CotG-gdh2；

(3)将重组质粒pEB03-CotG-gdhA转化至枯草芽孢杆菌WB600，得到重组枯草芽孢杆菌pEB03-CotG-GDH2；