[发明专利]牛胰蛋白酶的生产工艺

权利要求书

1.牛胰蛋白酶的生产工艺，其特征在于，利用基因重组技术在大肠杆菌中表达出牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白的包涵体蛋白，通过对包涵体蛋白胞外变性、酸化处理、复性、纯化操作，获得可激活的牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白，再通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白，得到有活性的牛胰蛋白酶；

其中，所述胞外变性、酸化处理是指将1g包涵体蛋白溶于20mL pH值8-9.5的变性液中，室温下搅拌3-5小时，然后用酸调变性液的pH至3.0，4℃9500rpm离心30min，上清液于-20℃保存；

复性是指向上清液中加入含有环糊精或其衍生物的复性液，于低温条件下复性；

所述变性液为50mM Tris+20mM DTT+8M尿素，或50mM Tris+20mM DTT+6M盐酸胍；所述复性液为50mM Tris+0.5％-5％环糊精或其衍生物+0.1％-1.5％PEG1000+1-2M尿素+试剂G，pH7.5-9.5；

其中，试剂G为5mM谷胱甘肽、1-5mM半胱氨酸、0-5mM胱氨酸中的至少一种；

使用阳离子交换柱对复性后的溶液进行纯化；其中，使用AKTAexplorer层析纯化系统，以GE SPbigbeads树脂为填料对复性后的溶液进行纯化，首先按1:100的体积比向复性后的溶液中加样缓冲液A进行稀释，然后4℃4000rpm离心30min，收集上清过柱，用缓冲液B按10倍柱体积进行洗脱，收集洗脱液；

其中，缓冲液A和缓冲液B选自如下组合：

缓冲液A：20mM醋酸钠，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠，pH4.5-6.5；

缓冲液A：20mM醋酸钠+10％乙醇，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+30％乙醇，pH4.5-6.5；

缓冲液A：20mM醋酸钠+0.5％PEG1000，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+1％PEG1000，pH4.5-6.5；

缓冲液A：20mM醋酸钠+5％甘油，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+5％甘油，pH4.5-6.5；

缓冲液A：20mM醋酸钠+1％吐温-20，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+1％吐温-20，pH4.5-6.5；

所述环糊精或其衍生物选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、甲基环糊精、乙基环糊精、羟丙基环糊精、丁基环糊精、磺丁基环糊精、磺酸酯环糊精、氨基环糊精、环糊精磷酸酯、羟乙基环糊精、三甲基环糊精、乙酰基环糊精、羧酸酯环糊精、硝酸酯环糊精、硫酸酯环糊精、葡萄糖基环糊精、麦芽糖基环糊精、半乳糖环糊精、琥珀酰环糊精；

按1:20-100的体积比向上清液中加入复性液进行稀释复性8-12小时。

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，调pH使用的酸为醋酸、硫酸、磷酸或盐酸。