[发明专利]分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对

权利要求书

1.烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变作为靶标在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用；所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变是指烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变，导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸突变为由FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸；小菜蛾多杀霉素敏感品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区TM4为FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸构成的疏水结构域；多杀霉素抗性品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区TM4为FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸。

2.分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法，其特征在于通过检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域是否发生9个碱基的缺失突变从而判定待测小菜蛾对多杀霉素的抗性，发生了所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾具有对多杀霉素抗性，未发生所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾不具备对多杀霉素抗性；烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由FCLFVFTLFTIIATVAVLL组成的19个氨基酸突变为由FCLFVFTLFTTVAVLL组成的16个氨基酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括用SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物R对烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因进行PCR扩增，通过对PCR产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳图谱直接鉴定小菜蛾个体α6亚基TM4跨膜区的编码基因是否存在由9bp的碱基缺失导致的IIA氨基酸的缺失突变及其具体类型，一次性区分该个体为对多杀霉素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的根据毛细管电泳图谱直接鉴定小菜蛾个体α6亚基TM4跨膜区是否存在IIA氨基酸的缺失突变及其具体类型，一次性区分该个体为对多杀霉素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的具体方法为：利用专用引物对扩增小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基，若PCR产物经毛细管电泳后显示为1个112bp的单峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素敏感型纯合子；若PCR产物经毛细管电泳后显示为1个112bp和1个103bp的双峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素抗性杂合子；若PCR产物经毛细管电泳后显示为1个103bp的单峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素抗性型纯合子。

5.根据权利要求4所述的分子检测方法，其特征在于包含如下三个步骤：

（1）提取小菜蛾单头幼虫或成虫样本的基因组DNA；

（2）利用SEQ ID NO.1所示的引物F和SEQ ID NO.2所示的引物R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增；

（3）将上一步获得的PCR产物进行毛细管电泳，通过毛细管电泳图谱检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4跨膜区碱基缺失情况，一次性区分检测小菜蛾个体是否为缺失3个氨基酸的多杀霉素抗性个体。

6.用于分子检测权利要求1中所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变的引物对，其特征在于由SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物R组成。

7.权利要求6所述的引物对在制备检测权利要求1中所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变所致小菜蛾对多杀霉素抗性的试剂盒中的应用。

8.权利要求6所述的引物对在检测权利要求1中所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变所致小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用。

9.一种用于检测权利要求1中所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变所致小菜蛾对多杀霉素靶标抗性的试剂盒，其特征在于包含权利要求6所述的引物对。

10.权利要求9所述的试剂盒对在分子检测权利要求1中所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基TM4缺失突变小菜蛾对多杀霉素靶标抗性中的应用。