[发明专利]鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物与探针

说明书

本发明一种鸟‑胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增(SAT)检测试剂盒及其专用引物与探针。本发明以16S rRNA的特异性区域作为检测靶标，专用引物对和探针高特异性、高灵敏度，试剂盒能够检测临床样本分离株中的鸟‑胞分枝杆菌(MAC)RNA，具有特异性高、灵敏度高、污染低及快速检测的特点，将在鸟‑胞分枝杆菌(MAC)的临床诊断中发挥作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测，特别是涉及一种基于核酸提取技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)的鸟-胞分枝杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物与探针。

背景技术

鸟-胞分枝杆菌(MAC)是鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌复合体的简称，是人型结核杆菌的近支抗酸菌，在结核杆菌以外的抗酸菌中，是从人分离频度最高的菌种，属于非结核分枝杆菌。

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的其它分枝杆菌。原称为非典型分枝杆菌，其特性有别于结核分枝杆菌，如对酸、碱比较敏感，对常用的抗结核菌药物较耐受，为条件致病菌。非结核分枝杆菌的生长温度不如结核分枝杆菌严格，大部分NTM是腐物寄生菌，存在于自然环境中，如水、土壤、灰尘等，常见于潮热地带，人和某些动物均可感染。

MAC因引起结核样病变而受到关注，MAC病具有与结核病临床表现相似的全身中毒和局部损害症状，主要侵犯肺部，在无菌种鉴定的情况下，可被误诊为结核病。

MAC肺病多发生于原有慢性肺部疾病，如支气管扩张症、尘肺、肺结核愈后的患者等。而在HIV/AIDS和免疫受损宿主中，MAC病通常表现为播散性。除MAC外，NTM引起肺部病变的主要菌种还有堪萨斯、脓肿、蟾蜍、偶发、马尔摩分枝杆菌等；MAC和瘰疬分枝杆菌还可引起淋巴结炎，前者更常见，次要菌种有偶发、龟、脓肿和堪萨斯分枝杆菌。引起播散型NTM病变的主要菌种有MAC、堪萨斯、龟、脓肿、嗜血分枝杆菌等。MAC和偶发分枝杆菌还可分别引起泌尿生殖系感染和眼部感染。

目前，MAC的鉴定方法主要有细菌学方法、色谱法和分子生物学方法。

细菌学方法目前仍是我国各大结核病防治院所中MAC菌种鉴定的常规方法。虽然近期有众多报道指出该方法由于局限性较多应被分子生物学等新兴方法所取代，但其也具备成本低、实验较易开展等优点。但是，该鉴定方法灵敏度低、特异性差、耗时长、准确性不尽如人意。

色谱法是鉴别缓慢生长NTM的快速、实用和可靠的方法，可用于直接鉴定Bactec7H12B分枝杆菌菌种及抗酸染色阳性标本中的MAC，其缺点是不能鉴别新的NTM菌种。

分子生物学方法克服以上缺点，已成为MAC快速鉴定的重要手段。DNA测序技术、PCR或多重PCR技术、基因芯片技术是目前最为常用的分子生物学方法。以上方法都是基于DNA水平的检测，易受环境中气溶胶的影响，极易交叉污染，出现假阳性，从而临床相关性差，无法区分潜伏感染与活动性感性，而且PCR为变温检测，对仪器要求高，扩增需Taqman酶，反应容易受抑制。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病原体的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病原体的特性进行专门设计。目前，尚无针对MAC的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、高灵敏度、高特异性、污染易控、设备简单、成本低廉的鸟-胞分枝杆菌(MAC)的实时荧光核酸恒温扩增(SAT)检测试剂盒。