[发明专利]利用交联蛋白质晶体作籽晶提高蛋白质结晶成功率的方法

说明书

本发明提供了一种利用交联蛋白质晶体作籽晶提高蛋白质结晶成功率的方法，首先生长蛋白质晶体，并对蛋白质晶体进行化学交联，将得到的交联蛋白质晶体溶于超纯水中，制得籽晶溶液；然后将籽晶溶液滴入结晶板的坐滴孔，自然晾干结晶板；最后利用筛选试剂盒对蛋白质进行结晶条件筛选，利用自动拍照系统观察蛋白质晶体的形貌，并统计蛋白质晶体的结晶条件数；收集并衍射蛋白质晶体，获取衍射数据。本发明选取交联蛋白质晶体作为籽晶，可以在空气中稳定存在，利于长期存储，并且可以重复利用；本发明可以有效地提高蛋白质结晶条件筛选的成功率。

技术领域

本发明涉及一种提高蛋白质结晶筛选成功率的方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的载体，蛋白质结构是决定其生理功能的重要前提。目前，获取高质量的单晶是利用X-射线衍射技术解析蛋白质精细三维结构的关键，也是此技术的瓶颈问题。如何筛选得到蛋白质的结晶条件是获得高质量蛋白质单晶的第一步，然而，从高纯蛋白质到获得衍射质量的蛋白质晶体的成功率不足20％，因此，提高蛋白质晶体的结晶成功率迫在眉睫。

用于提高蛋白质结晶筛选成功率的方法有很多种，包括共结晶、改善界面、控制变温方式、籽晶法等。文献1：“An automated microseed matrix-screening method forprotein crystallization[J].Acta Crystallographica Section D,2007,63(4):550-554.”报道了籽晶法可以使蛋白质的结晶成功率提高2.5～65倍；文献2:“Microseedmatrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase[J].ActaCrystallographica Section D,2004,60(3):601-605”报道了利用低分辨率的蛋白质晶体作为籽晶优化蛋白质的结晶条件，可以获得高分辨率的蛋白质晶体，进而获取衍射数据。然而，该方法制备的籽晶溶于水和有机溶剂，只能使用一次，成本昂贵。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种利用交联的蛋白质晶体作为籽晶用于蛋白质结晶的方法，利用交联剂对常规方法制备的蛋白质晶体进行交联，得到可在空气稳定存在的交联蛋白质晶体。然后利用交联蛋白质晶体作为籽晶，可以有效地提高蛋白质结晶条件筛选的成功率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先制备交联蛋白质晶体籽晶溶液，然后把籽晶溶液滴加在结晶板上，最后进行蛋白质结晶成功率的筛选。具体步骤如下：

第一步，生长蛋白质晶体，并对蛋白质晶体进行化学交联，将得到的交联蛋白质晶体溶于超纯水中，浓度均为5-20mg/ml，制得籽晶溶液；

第二步，在结晶板的每个坐滴孔中滴入0.5-2μl的籽晶溶液，自然晾干结晶板；

第三步，利用Index^TM筛选试剂盒对蛋白质进行结晶条件筛选，首先制备蛋白质溶液；然后向结晶板的每个深孔中加入80μl的池液，将筛选结晶剂和蛋白质溶液按照1：1的质量比混合得到结晶溶液，将2μl的结晶液滴滴入结晶板的坐滴孔，密封结晶板，并在277-293K的结晶温度下结晶3-7天；

第四步，观察蛋白质晶体的形貌，统计蛋白质晶体的结晶条件数；收集并衍射蛋白质晶体，获取衍射数据。

所述的籽晶溶液选用交联溶菌酶作为籽晶。

所述的籽晶溶液选用质量比为1：1的交联溶菌酶和过氧化氢酶晶体作为籽晶。

所述的籽晶溶液选用质量比为1：1：1：1：1的交联溶菌酶晶体、过氧化氢酶、蛋白质酶K、奇异果甜蛋白质和糜蛋白酶原A II晶体作为籽晶。

所述的化学交联过程中把结晶母液全部置换成交联溶液。

本发明的有益效果是：