[发明专利]一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明提供一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够产生抗牛支原体的单克隆抗体，并用于检测牛支原体。该杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC C2015183，保藏日期为：2015年11月8日。本发明的优点在于：本发明所获得的细胞株能够特异性的分泌针对牛支原体的单克隆抗体，具有较好的灵敏度和较高的特异性。本发明的优点还在于：利用本发明获得的细胞株所产生的抗体能够应用于多种途径，对实际生产有较好的应用价值。

技术领域

本发明涉及一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

支原体(Mycoplasma)，又称霉形体，属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，其大小介于细菌和病毒之间，是目前已知的能够在无生命培养基中生长繁殖的最小原核微生物，并能够通过0.22μm的细菌滤器。由于支原体缺乏细胞壁，因此具有多形性，且对作用于细胞壁的抗生素有抵抗力。在固体培养基上，支原体菌落呈露滴状、煎蛋样或颗粒状。自1898年法国科学家Nocard等人首次从呼吸道疾病患病牛肺脏组织中分离出该类微生物以来，人、动物、植物及昆虫源性的此类微生物相继被分离鉴定。1967年，该类微生物被国际细菌命名委员会正式命名为支原体并沿用至今。迄今为止，分离鉴定的支原体已达190种以上，其中许多种类可对人、动物、植物及昆虫致病，造成极大危害。

牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是牛呼吸系统疾病的主要病因之一，其感染可导致牛的肺炎、耳炎、关节炎、精囊炎、乳房炎、生殖道炎症、流产及不孕症等疾病。1961年，美国人Hale等首次在乳房炎患病牛中分离到该病原，1976年，其致病性被证实。此后，牛支原体感染迅速向世界各地传播蔓延，并遍布欧洲、大洋洲、美洲以及亚洲。其中以欧洲最为严重，所造成的损失亦最为惨重。仅在英国，每年约有190万头牛感染发病，且死亡率高达82.％，经济损失约为5400万英镑(Reeve-Johnson,1999)。而美国牛群中牛支原体感染率高达70％，每年的经济损失约为1.08亿美元(Rosengarten and Citti，1999)。在我国，黎济申等人于1983年首次从国内乳腺炎病牛的乳汁分离到牛支原体，证实了我国牛群牛支原体感染的存在。2008年，辛九庆等人从传染性坏死性肺炎病死犊牛肺脏中分离出牛支原体，随后证实该病在全国大部分地方普遍流行，且其发病率高达50％-100％，病死率通常为10％-50％。由于目前尚无理想的疫苗进行预防，加之该病原具有多重耐药性，因此，该病给我国养牛业造成了巨大的经济损失。基于此，快速、准确的牛支原体检测方法的建立，必将为该病的有效防控奠定基础。

目前，牛支原体肺炎的诊断以实验室诊断为主。虽然分离和鉴定牛支原体的方法最为确实，但其耗时较长。而用常规的抗体检测方法诊断牛支原体肺炎则灵敏度低，非特异性高。虽然PCR和环介导等温扩增技术灵敏度高，但却极易因核酸的污染而出现假阳性，且PCR技术需要特殊的仪器设备，因此其难以普及。应用单克隆抗体建立的牛支原体检测方法，虽然灵敏度较高，但通常难以对牛支原体和无乳支原体进行有效鉴别。

发明内容

本发明针对目前检测牛支原体存在的问题，提供了一株能产生与牛支原体发生抗原抗体反应的IgG1亚型抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

本申请人通过对牛支原体基因组的分析，发现牛支原体不同菌株的脂蛋白P48基因高度保守，国内外来源的不同菌株其脂蛋白P48基因序列完全一致。而该基因序列与无乳支原体的相关基因序列存在一定的差异，两者的同源性约为80％左右。因此，申请者设计引物对牛支原体脂蛋白P48基因进行了扩增和原核表达，以纯化的表达产物为抗原免疫Balb/c小鼠，在细胞融合的基础上筛选出了可分泌牛支原体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，并利用所分泌的单克隆抗体，建立了特异强、灵敏高的牛支原体双抗夹心ELISA检测方法。

本发明提供一株分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为：CCTCCC2015183，保藏日期为：2015年11月8日，细胞分类命名为：杂交瘤细胞株NZYT-ZJC，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学。