[发明专利]用于对试样进行光片显微检测的方法

说明书

本发明涉及一种用于对试样(1)进行光片显微检测的方法，其中，选择多个曝光波长，基于所述多个曝光波长将针对试样(1)的曝光光线集中起来。针对平均波长，将相位选择元件的调制深度确定为π。这里，对于相位选择元件表现出预设的相分布并且对于孔板平面的孔板(24)表现出预设的孔板结构，其实现了，基于多个曝光波长将曝光光线集中起来且利用从多色组成的光片对试样(1)曝光。为此，选出优先波长，且在曝光物镜(10)的焦平面中，针对预设形状的光片，利用优先波长的光确定出光片的电场。由此计算出要预设的相分布。相位选择元件被以曝光光线曝光，并且曝光光线借助于相位选择元件结构化。经结构化的曝光光线成像到孔板平面中，多色的经结构化的光线的零阶在孔板平面中被消隐，使得在布置于后面的曝光物镜(10)的焦平面中，成形有经结构化的光片，具有垂直于曝光物镜(10)的焦平面设置的光片平面。试样(1)被以结构化的光片在光片平面中曝光，从试样射出的光线沿检测方向得到检测，检测方向与光片平面围成不为零的角度。

技术领域

本发明涉及一种用于对试样进行光片显微检测的方法以及主要涉及对利用多种染料标记的试样进行分析的问题。

背景技术

对生物试样的研究在近年来越来越重要，其中，试样的照射被利用光片实现，光片的平面(光片平面)与检测的光轴(检测方向)夹成不为零的角度相交。通常，光片平面在此与检测方向(一般相对于检测物镜的光轴)夹成不为零的、但通常也不一定是直角的角度。这种研究方法主要用在荧光显微成像中并且被归纳为术语LSFM(光片荧光显微术)。示例是在DE10257423A1以及以上述文献为基础构成的WO2004/0535558A1介绍的而且称为SPIM(选择性平面照明显微术)的方法，利用这种方法，在相对短的时间内也能够在空间上容纳比较厚的试样：基于光学剖面，在与沿垂直于剖切平面的方形的相对运动组合下，能够对试样进行图像上/空间上拉伸的显示。

相对于其他设计的方法，诸如共焦激光扫描显微术或者双光子显微术，LSFM方法具有多种优点。因为能够实现在宽视场内的检测，所以能够检测更大的试样区域。虽然分辨率略低于共焦激光扫描显微术的情况，但是，能够利用LSFM技术分析较厚的试样，因为透入深度较大。此外，在这种方法中，对试样的光负荷加载最低，这降低了试样褪色的风险，因为试样仅受到薄的光片以相对于检测方向不为零的角度照射。

替代纯静置的光片，也可以产生一定程度上静置的光片，方式为：试样以光束快速扫描。光片类型的照明以如下方式产生，光束相对于需要观察的试样经历非常快速的相对运动并且在此，在时间上彼此跟随地多重地并排排列。在此，照相机的在其传感器上成像出试样的合成时间以如下方式选择，使得扫描在积分时间内结束。

光片显微术的主要应用在于对几百微米直至几毫米的中等大小的生物体的成像。一般，生物体嵌入凝胶中，例如琼脂中，凝胶又处在玻璃毛细管中。玻璃毛细管从上方或从下方被嵌入填入水的试样腔室中，并且试样作为一块被从毛细管中压出。琼脂中的试样被以光片照明，并且荧光利用成像物镜(其优选、但是一定垂直于光片、进而也垂直于用于产生光片的光学系统的照明物镜而置)成像到照相机上。

但是，光片显微成像术的方法具有一定局限。一方面，需要研究的试样相对较大，该试样来自发展生物学。第二方面，由于试样制备和试样腔室的尺寸，光片相对较厚并且进而能够实现的轴向解析度受到限制。第三，试样的制备很复杂并且不与针对单个细胞的荧光显微术的标准试样制备和标准试验固定相兼容。

为了部分地规避上述限制，在近年来，实现了新型的结构，其中，照明物镜和检测物镜优选彼此垂直而置并且以45°的角度朝向上方指向试样。操作方式例如在WO2012/110488A1以及在WO2012/122027A1中介绍。