[发明专利]用于测定BoNT/E在细胞中的生物活性的装置和方法

权利要求书

1.特异性结合BoNT/E切割的SNAP-25的单克隆抗体在用于体外测量BoNT/E的生物活性的测定法中的用途，其中所述抗体包含以下的互补决定区(CDR)：由杂交瘤细胞系pCNEI32-7-1,3614-000产生的单克隆抗体所包含的如SEQ ID NO.15所示的CDR-L1、如SEQ IDNO.16所示的CDR-L2、如SEQ ID NO.17所示的CDR-L3、如SEQ ID NO.18所示的CDR-H1、如SEQID NO.19所示的CDR-H2和如SEQ ID NO.20所示的CDR-H3，所述杂交瘤细胞系于2014年12月17日以入藏登记号DSMACC3261保藏在DSMZ–DeutscheSammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体特异性结合由具有如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的氨基酸序列的肽组成的表位。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述抗体包含由杂交瘤细胞系pCNEI 32-7-1,3614-000产生的单克隆抗体所包含的如SEQ ID NO.22所示的VH区和如SEQ ID NO.21所示的VL区，所述杂交瘤细胞系于2014年12月17日以入藏登记号DSMACC3261保藏在DSMZ–Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe7B,38124Braunschweig,Germany。

4.一种用于直接体外测定BoNT/E在细胞中的生物活性的方法，其包括以下步骤：

a)在允许BoNT/E发挥其生物活性的时间和条件下用所述BoNT/E温育对BoNT/E中毒敏感的细胞；

b)固定所述细胞，并且任选地用洗涤剂使所述细胞透化；

c)使所述细胞至少与特异性结合非切割的和BoNT/E切割的SNAP-25的第一捕获抗体以及至少与特异性结合BoNT/E切割的SNAP-25的第二捕获抗体在允许所述第一捕获抗体与非切割的和BoNT/E切割的SNAP-25结合以及允许所述第二捕获抗体与BoNT/E切割的SNAP-25结合的条件下接触，其中所述第二捕获抗体是根据权利要求1至3中的任一项所述的单克隆抗体；

d)使所述细胞至少与特异性结合所述第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，因此形成第一检测复合物，以及使所述细胞至少与特异性结合所述第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，因此形成第二检测复合物，并且其中所述第一检测抗体不同于所述第二检测抗体；

e)测定步骤d)的所述第一检测复合物和第二检测复合物的量；和

f)借助于所述第二检测复合物来计算在所述细胞中通过BoNT/E切割的SNAP-25的量，

从而确定所述BoNT/E在所述细胞中的生物活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述BoNT/E包含如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述细胞是选自以下的神经元细胞或神经元分化细胞：原代神经元细胞，能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞或诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞为神经母细胞瘤细胞或P19细胞。

8.根据权利要求4所述的方法，其中通过加入选自以下的固定剂来固定所述细胞：甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或其混合物。