[发明专利]一种用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法

权利要求书

1.一种用于鉴定样品中的含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品或其他样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列，所述方法包括：

提供含有的一个或多个核酸分子的样品，所述一个或多个核酸分子潜在含有因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于其他核酸分子中的所述核苷酸序列的所述靶核苷酸序列；

提供能够消化所述样品中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一种或多种酶；

提供一个或多个一级寡核苷酸引物组，每个一级寡核苷酸引物组包括(a)第一一级寡核苷酸引物，其包含与邻近所述靶核苷酸序列的序列互补的核苷酸序列，和(b)第二一级寡核苷酸引物，其包含与由所述第一一级寡核苷酸引物形成的延伸产物的一部分互补的核苷酸序列；

将所述样品、所述一个或多个一级寡核苷酸引物组、能够消化所述样品中的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶链式反应混合物；

使所述聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成包含所述靶核苷酸序列或其互补序列的一级延伸产物；

将所述一级延伸产物与连接酶和一个或多个寡核苷酸探针组共混以形成连接反应混合物，其中每个寡核苷酸探针组包括(a)第一寡核苷酸探针，其具有5’引物特异性部分和3’靶核苷酸序列特异性部分，和(b)第二寡核苷酸探针，其具有5’靶核苷酸序列特异性部分和3’引物特异性部分，并且其中探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针被构造成以碱基特异性方式杂交于一级延伸产物的互补靶核苷酸序列上；

使所述连接反应混合物经历一个或多个连接反应循环，由此将所述一个或多个寡核苷酸探针组的所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针连接在一起以在所述连接反应混合物中形成连接产物序列，其中每个连接产物序列包含所述5’引物特异性部分、所述靶特异性部分和所述3’引物特异性部分；

提供一个或多个二级寡核苷酸引物组，每个二级寡核苷酸引物组包括(a)第一二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述5’引物特异性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二级寡核苷酸引物，其包含与所述连接产物序列的所述3’引物特异性部分互补的核苷酸序列；

将所述连接产物序列、所述一个或多个二级寡核苷酸引物组、能够消化含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一种或多种酶、包含dUTP的脱氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶链式反应混合物；

使所述第二聚合酶链式反应混合物经历适于消化所述第二聚合酶链式反应混合物中存在的含有脱氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的条件，以及包括变性处理、杂交处理和延伸处理的一个或多个聚合酶链式反应循环，从而形成二级延伸产物；以及

对所述样品中的所述二级延伸产物进行检测和区分以鉴定含有靶核苷酸序列的一个或多个核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一种或多种核苷酸、一个或多个拷贝数、一种或多种转录物序列和/或一个或多个甲基化残基而不同于所述样品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。