[发明专利]生物催化环化香叶基芳樟醇的方法和由此获得的环化产物

说明书

本发明涉及使用来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,Zm-SHC)的角鲨烯-藿烯(squalene-hopene)环化酶或与Zm-SHC具有至少80％序列同一性的环化酶来环化香叶基芳樟醇(geranyllinalool)的新方法，以及在该方法中获得的环化产物。

背景技术

已经阐明了在相应的生产生物体中大量单萜的生物合成。通常，线性前体分子被高度特异性的生物催化剂环化。这些前体通常是直链萜醇和二磷酸(diphosphoric acid)的酯。这样的前体的典型实例是焦磷酸香叶酯。焦磷酸盐基团从分子中被酶促消除，随后水解得到两个磷酸根离子。另一方面，这产生了碳阳离子，其现在能够进行进一步的分子内反应并重组以产生环状单萜，例如消除质子(Curr.Opin.Chem.Biol.2009,13:180-188)。

众所周知，非激活三萜烯如角鲨烯或氧鲨烯(oxidosqualene)在体内通过角鲨烯-藿烯环化酶(SHC)反应，得到相应的环状化合物(Siedenburg,G.和Jendrossek,D.,应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology),2011,77,(12),3905)。

某些角鲨烯-藿烯环化酶(SHC)的活性并不限于三萜烯。将其公开内容完整引入本文的国际申请PCT/EP2011/070304(WO 2012066059 A2)，描述了角鲨烯-藿烯环化酶突变体，其催化香茅醛异构体环化成异蒲勒醇异构体。

将其公开内容完整引入本文的国际申请PCT/EP2010/057696(WO 2010139719 A2)，提出了角鲨烯-藿烯环化酶作为用于将homofarnesol环化成ambroxan的生物催化剂。

来自细菌运动发酵单胞菌(Zm-SHC)的角鲨烯-藿烯环化酶的基因和蛋白质序列是已知的(Genpept Accession No AAV90172 2004和Nat Biotechnol 2005,23:63-68,参见SEQ ID No.1和2)。

本发明的目的是提供一种使香叶基芳樟醇环化的方法。

发明概述

通过式(I)化合物的生物催化环化的方法解决了上述问题，

在具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID No.2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的环化酶存在下进行。

优选地，式(I)化合物在本发明的方法中反应，得到至少一种式(II)化合物。

本发明还涉及式(II)的化合物。

发明详述

A.一般定义

为了本发明的目的，“环化酶”通常是酶或酶突变体，其具体显示香叶基芳樟醇环化酶的活性。香叶基芳樟醇环化酶的活性是指香叶基芳樟醇(I)的异构化的酶活性，其形成至少一个5或6元环，具体地讲是类似色烯，特别是类似苯并色烯的环化结构。具有香叶基芳樟醇环化酶活性的合适的酶是来自异构酶亚类的分子内转移酶；也就是EC编号为EC 5.4的蛋白质(根据Eur.J.Biochem.1999,264,610-650的酶代码)。具体地讲，它们采取EC 5.4.99.17代表的形式。具体地讲，具有香叶基芳樟醇环化酶活性的合适的酶是还引起homofarnesol环化成ambroxan，香茅醛异构体环化成异蒲勒醇异构体，或角鲨烯环化成藿烯的那些酶(因此有时也称为“SHC”角鲨烯-藿烯环化酶)，并且在国际申请PCT/EP2010/057696和PCT/EP2011/070304中有详细描述，在此明确地引用这一点。

由于酶反应的可逆性，本发明涉及两个反应方向的本文所述的酶反应。

“环化酶”的“功能突变体”包括这些酶的“功能等同物”，其在下文中定义。

术语“生物催化方法”涉及任何“式(I)化合物的生物催化环化方法”，即在粗制、纯化、溶解、分散或固定化酶存在下的方法，或在显示或表达香叶基芳樟醇环化酶活性的微生物的显示环化酶细胞的存在下。因此，生物催化过程包括酶和微生物过程以及发酵过程。

术语“立体专一性”是指具有至少一个不对称中心的化合物的几种可能的立体异构体之一，该化合物根据本发明产生，是通过本发明酶的作用在高“对映体过量”或高“对映体纯度”中产生，例如至少90％ee，具体地讲是至少95％ee或至少98％ee或至少99％ee。ee％值由以下公式计算：