[发明专利]使用成对向导RNA进行靶向遗传修饰的方法和组合物

权利要求书

1.一种用于对细胞内的基因组靶基因座进行双等位基因修饰的体外方法，包括：

(I)向为非人类细胞、非多能的人类细胞，或直接源自分化的成年细胞的人类诱导性多能干细胞的细胞群引入：

(a)Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸；

(b)第一向导RNA或编码所述第一向导RNA的DNA，其中所述第一向导RNA与所述基因组靶基因座内的第一CRISPR RNA识别序列杂交；

(c)第二向导RNA或编码所述第二向导RNA的DNA，其中所述第二向导RNA与所述基因组靶基因座内的第二CRISPR RNA识别序列杂交；以及

(d)靶向载体，其包含侧接5’同源臂和3’同源臂的核酸插入物，其中所述5’同源臂与所述基因组靶基因座内的5’靶序列杂交，所述3’同源臂与所述基因组靶基因座内的3’靶序列杂交，其中如果所述细胞群为1细胞期胚胎群，则所述靶向载体的长度不超过5kb；

其中所述基因组包含一对第一同源染色体和第二同源染色体，这对染色体包含所述基因组靶基因座；并且

其中所述Cas蛋白切割所述第一CRISPR RNA识别序列和所述第二CRISPR RNA识别序列中的至少一者，以在所述第一同源染色体和所述第二同源染色体的每一者中产生至少一处双链断裂；以及

(II)鉴定具有经修饰的基因组靶基因座的细胞，所述经修饰的基因组靶基因座包含双等位基因修饰，所述双等位基因修饰包括缺失和/或插入

其中所述鉴定包括定量+-的等位基因修饰测定和保留测定，

其中所述等位基因修饰测定包括:

(a)等位基因获得测定，以确定来自所述细胞的基因组DNA样品中所述核酸插入物的区域的拷贝数；和/或

(b)等位基因丢失测定，以确定所述基因组DNA样品中靶向缺失的所述基因组靶基因座的区域的拷贝数，和，

其中所述保留测定确定基因组DNA样品中与所述5’同源臂杂交的所述5’靶序列的区域的拷贝数和/或确定所述基因组DNA样品中与所述3’同源臂杂交的所述3’靶序列的区域的拷贝数，以及

其中所述等位基因修饰测定和所述保留测定的组合区分将所述核酸插入物正确靶向插入到所述基因组靶基因座中和将所述核酸插入物随机插入到所述基因组靶基因座外的基因组位置中的随机转基因插入，和/或区分正确的靶向缺失和延伸超出被靶向缺失的所述基因组靶基因座的区域的缺失。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述等位基因修饰测定包括所述等位基因获得测定，且其中所述等位基因获得测定确定所述基因组DNA样品中所述核酸插入物的多个区域的拷贝数。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述等位基因修饰测定包括所述等位基因丢失测定，且其中所述等位基因丢失测定确定所述基因组DNA样品中靶向缺失的所述基因组靶基因座的多个区域的拷贝数。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸插入物包括选择盒，且其中：

（1）所述5’靶序列与所述选择盒邻近，所述保留测定确定所述5’靶序列的区域的拷贝数；或

（2）所述3’靶序列与所述选择盒邻近，所述保留测定确定所述3’靶序列区域的拷贝数。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤（II）包括鉴定包含经修饰的基因组靶基因座的细胞，所述基因组靶基因座包含缺失，其中步骤（II）包括所述保留测定和所述等位基因丢失测定，且其中所述保留测定中小于2的拷贝数表示Cas介导的缺失延伸超出靶向缺失的所述基因组靶基因座的区域。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述保留测定确定所述基因组DNA样品中所述5’靶序列的区域的拷贝数和所述3’靶序列的区域的拷贝数。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述等位基因修饰测定包括所述等位基因丢失测定和所述等位基因获得测定。