[发明专利]小型RNA的表达量的修正方法和装置

说明书

为了在多个样本之间对目标小型RNA的表达量进行比较分析，而公开了能够利用标准物质正确地修正该表达量的测定值的方法。在本发明的小型RNA表达量的修正方法中，使用核酸长度为200个碱基以上的核酸作为标准物质。将一定量的上述标准物质添加到一定量的各样本中，从样本提取核酸，测定提取的各目标小型RNA和标准物质的量，使用标准物质的提取量的测定值修正目标小型RNA的表达量。根据本发明，能够比现有方法更正确地进行各样本之间的小型RNA的表达量的修正。

技术领域

本发明涉及用于对多个样本所含的目标小型RNA的表达量进行比较 分析的表达量修正方法和进行该表达量修正的装置。

背景技术

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是不编码蛋白质的RNA的总 称，大致分为持家RNA和调控类RNA。存在各种长度的ncRNA，特别是 小于200个碱基的分子被称为小型RNA(small RNA)。

作为持家RNA，已知核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、参与 剪接的核内小分子RNA(snRNA)、参与rRNA的修饰的核仁小分子 RNA(snoRNA)等。

调控类RNA作为对生物体功能的阐明发挥重要功能的因子近年来特 别受到关注，最近逐渐明确了其调节基因表达、RNA的细胞内分布，对基 因表达抑制机制发挥重要作用。由该调控类RNA发挥功能的基因表达抑 制机制被称为RNA干涉(RNAi)，1988年在使用线虫的实验中被发现，然 后证明了在果蝇、哺乳类细胞中也存在同样的机制。作为该调控类RNA的ncRNA链长为约20～25个碱基，其作用机制大体分为通过微 RNA(miRNA)的翻译抑制，和利用小干涉RNA(small interference RNA， siRNA)的目标mRNA的切割以及介由目标DNA区域的异染色质化的基因 沉默。

miRNA由基因组DNA作为发夹样结构的RNA(前体)转录出来。该前 体被具有特定的酶RNase III切割活性的dsRNA切割酶(Drosha、Dicer) 切割后，变成双链的形态，然后变成单链。并且，认为一条反义链被称为 RISC的蛋白质复合体摄入，参与mRNA的翻译抑制。这样，因为miRNA 在转录后各阶段其形态不同，所以通常在以miRNA为目标(检测对象)的情况下，需要考虑发夹结构体、双链结构体、单链结构体等各种形态。miRNA 由15～25个碱基的RNA组成，在各种生物中确认了其存在。

近年来发现，miRNA不仅在细胞内存在，在不含细胞的样本(生物体 试样)血清、血浆、尿、脊髓液等体液中也较多存在，启示其表达量可能成 为以癌为代表的各种疾病的生物标志物。miRNA在2014年6月的现在， 在人中存在2500种以上(miRBase Release 20)，在利用高灵敏度的DNA 微阵列等测定体系的情况下，其中超过1000种的miRNA能够在血清·血 浆中同时检测到表达。于是，进行了使用DNA微阵列法以血清·血浆、尿、 脊髓液等体液为对象的生物标志物探索研究。

已知在使用DNA微阵列进行基因表达分析时，根据样本、实验者、 实验条件不同，所得的测定值(数据)可能产生误差。因此，考察了用于修 正误差的测定值的修正方法。修正中通常常用以对于任何样本，在取多个 基因的表达量的测定值一起作为基因表达数据群的情况下，表达量都没有 差异这样的原理为前提的方法，是整体归一化(globalnormalization)法、分 位数(quantile)法、局部加权回归散点平滑法(lowess)法、75％分位数(75 percentile)法等。但是这些修正方法有仅能在某一定数量以上整体地检测 基因时使用这样的缺点。

另一方面，还进行了着眼于样本之间表达量相同的特定的基因(β-肌动 蛋白、GAPDH等)，对样本逐个修正数据使得该基因的测定值为一定的方 法。