[发明专利]包括内部核糖体进入位点的质粒和其用途

说明书

在一些方面，本申请涉及可用于在特异性扰动之后有效监测数千个蛋白的稳定性的质粒的开发。所述质粒允许两种报道基因蛋白的共表达，两种均处于IRES的控制下。本发明的其它方面涉及质粒文库，识别通过所关注的化合物调节其水平的蛋白的筛选方法以及用于监测用IMiD化合物治疗受试者的方法。

相关申请案

本申请案主张根据2015年4月30日提交的美国临时申请案第62/154,858号和2014年10月10日提交的美国临时申请案第62/062,245号的35U.S.C.§119(e)的权益，每个申请案的全部内容以全文引用的方式并入本文中。

联邦政府资助的研究

本发明根据美国国立卫生研究院授予的2R01CA068490-19和2R01CA076120-13在政府支持下进行。政府拥有本发明中的某些权利。

背景技术

报道基因测定已经在制药和生物技术工业中常规地使用以识别影响蛋白功能的前导化合物。在近十年中，化学家在短时间内通过如组合化学反应的技术合成大量化学化合物的能力已大大提高，并且常常需要筛选数千到数百万的化合物以识别对所关注蛋白质具有期望效应的那些化合物。

通常，报道基因测定测量在样品中的一种报道基因蛋白的活性，但是可结合多种报道基因。用于共表达多种报道基因的一个策略涉及双顺反子构建体的设计，其中通过内部核糖体进入位点(IRES)序列分隔开的两种基因在常见上游启动子的控制下表达为单个转录盒(或双顺反子转录)(延(Yen)等人，《科学(Science.)》2008年11月7日；322(5903)：918-23)。插入IRES序列充当用于有效的帽独立性内部翻译起始的核糖体结合位点。此类设计实现具有IRES引导的帽独立性翻译的两种基因两者的转录。此系统允许在实验处理时不期望改变的对照报道基因与在每个测试样品中归一化为所述对照的测试报道基因一起共表达。然而，相比于帽独立性翻译，在细胞中的许多扰动可差异地影响帽依赖性翻译。此外，一些IRES已经示出显示下游基因的可变表达(王(Wong)等人《基因疗法(Gene Ther.)》2002年3月；9(5)：337-44)。这导致高的假阳性和不可靠的报道基因测定。因此，存在用于分析蛋白稳定性的有效高通量方法的需要，其中报道基因活性的非特异性变异用于控制在细胞类蛋白稳定性测定中的固有变化。这使得降低有效且高效地运行HTS测定所需要的数据的错误。

发明内容

在一些方面，本公开涉及可用于在特异性扰动之后有效地监测数千蛋白的稳定性的质粒的开发。

在一些方面，本公开提供一种DNA质粒。所述质粒包括可操作连接启动子；第一内部核糖体进入位点(IRES)；编码第一报道基因蛋白的核苷酸序列；第二IRES；以及编码第二报道基因蛋白的核苷酸序列，其中开放阅读框(ORF)融合到编码第一报道基。因蛋白的所述核苷酸序列或融合到编码第二报道基因蛋白的所述核苷酸序列。