[发明专利]用于制备细胞结合剂‑细胞毒性剂缀合物的方法

说明书

相关申请的引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2014年11月19日提交的美国临时申请号62/081,914的提交日期的权益，所述申请的全部内容(包括所有附图、式、说明书、权利要求书和序列表)以引用的方式并入本文。

发明背景

适用于治疗癌症和其他疾病的抗体-药物-缀合物(ADC)通常由三种不同的元素组成：细胞结合剂；接头；以及细胞毒性剂。将细胞结合剂(如抗体)与细胞毒性剂缀合的常规方法采用两个不同的反应步骤。在第一反应步骤中，使抗体与双功能交联试剂反应以产生接头修饰的抗体。然后任选地从过量的接头或水解的接头试剂纯化修饰的抗体产物。在第二反应步骤中，使接头修饰的抗体与含有反应性基团例(如硫醇)的细胞毒性剂反应以产生抗体-细胞毒性剂缀合物，所述缀合物在另外的纯化步骤中再次纯化。这种常规方法可能需要两个纯化步骤，这降低了总体产率并且使得所述方法对于大规模制造ADC来说是繁琐且不经济的。

或者，细胞毒性剂可首先与双功能交联试剂反应以形成细胞毒性剂-接头化合物，然后使所述化合物与细胞结合剂反应以形成细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物(缀合反应)。细胞毒性剂、双功能交联试剂和所得到的细胞毒剂-接头化合物通常是疏水性化合物，并且在水中具有低溶解度。因此，需要在缀合反应中存在一定量的有机溶剂以溶解细胞毒性剂-接头化合物。另一方面，大量有机溶剂的存在可能对抗体稳定性具有不利影响。因此，当使用低浓度的细胞结合剂、细胞毒性剂和/或双功能交联试剂时，本领域的方法可能局限于细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的小规模制备。

鉴于前述，需要开发用于制备具有高抗体稳定性的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物并且适合于大规模生产的改进的方法。

发明概述

本发明提供适于大规模生产抗体-药物-缀合物(ADC)的新型方法。所述方法包括以下步骤：

(a)使细胞毒性剂与由以下结构式表示的双功能交联试剂：

或其盐在包含缓冲剂的缓冲溶液中反应，以提供包含细胞毒性剂-接头化合物的第一混合物，其中所述缓冲溶液具有高缓冲能力；以及

(b)使来自步骤(a)的第一混合物中的细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂在pH为4至9的溶液中反应，以提供包含所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的第二混合物。

已经出人意料地发现，与在步骤(a)的反应中使用低缓冲能力的缓冲溶液制备的缀合物相比，当在步骤(a)的反应中使用高缓冲能力的缓冲溶液时，所得到的细胞结合剂缀合物具有显著更少的抗体片段化。此外，高浓度的细胞结合剂(例如，抗体)可用于缀合反应(即，本发明方法的步骤(b))中，这使得所述方法对于大规模生产来说更加经济。此外，与本领域的方法相比，缀合溶液中需要较少量的有机溶剂(例如，二甲基乙酰胺(DMA))，这可增加抗体和所得到的缀合物的稳定性。

本发明的方法提供具有高纯度和/或稳定性的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。具体地说，与现有技术中描述的方法相比，本发明的方法减少抗体片段化。

本发明还涉及使用本文所述的方法制备的细胞结合剂细胞毒性剂缀合物。

发明详述

本发明提供一种用于制备细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的新型方法。所述方法包括以下步骤：

(a)使细胞毒性剂与由以下结构式表示的双功能交联试剂：

或其盐在包含缓冲剂的缓冲溶液中反应，以提供包含细胞毒性剂-接头化合物的第一混合物，其中所述缓冲溶液具有高缓冲能力；以及

(b)使从步骤(a)获得的第一混合物中的细胞毒性剂-接头化合物与细胞结合剂在pH为4至9的溶液中反应，以提供包含所述细胞结合剂细胞毒性剂缀合物的第二混合物。

如本文所用，“盐”是指本文所述的化合物的衍生物，其中通过制备母体化合物的酸盐或碱盐对母体化合物改性。更具体地说，盐是指其中通过使母体化合物与无机或有机碱如碱金属氢氧化物或烷基胺反应来改性母体化合物的衍生物。在一个实施方案中，所述盐是钠盐。或者，所述盐是三烷基铵盐，例如N,N-二异丙基乙基铵盐。