[发明专利]利用弗氏志贺菌腺苷三磷酸双磷酸酶的分析和诊断方法

说明书

技术领域

本发明涉及污染性核苷酸的分析和诊断方法。具体地，本发明涉及测定或定量可能含有污染性核苷酸的样品中的ATP的量，以及用于这种方法的试剂和这种试剂的生产。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是存在于所有活细胞中的分子。由于细胞中ATP的浓度相当恒定，所以测量样品中ATP的含量可以作为确定活细胞数量的替代方法。通过基于荧光素酶/荧光素的敏感生物发光分析法来测量ATP是公知的，例如见美国专利US3745090。荧光素酶(例如来自萤火虫的荧光素酶)是一种微球蛋白，其使用ATP和分子氧催化荧光素的氧化脱羧反应，形成氧化荧光素，氧化荧光素是一种高度不稳定的单级激发化合物，其在回到基态时发光。该反应的发光与反应混合物中的ATP浓度成正比，通过检测发射光的强度，可以连续监测存在的ATP的浓度。

在许多情况下，待分析ATP含量的样品含有胞外或存在于污染类型的细胞中的污染性ATP。例如，如果要在任何临床或生物样品中测定细菌的数量，那么样品中宿主细胞所含的任何ATP将对测量产生干扰。在许多应用中，污染性细胞可以选择性裂解并释放ATP，导致所有污染性ATP都是胞外形式，例如见美国专利US4303752或US20110076706。在其它情况下，样品中可能存在ATP类似物而非ATP，也对ATP测量产生干扰。

可以用称为腺苷三磷酸双磷酸酶(ATP-二磷酸水解酶、E型ATP酶、ATPD酶、NTDase EC 3.6.1.5)的酶进行水解来减少或消除污染性胞外ATP，或者不想要的ATP或ATP类似物。腺苷三磷酸双磷酸酶常常在有哺乳动物细胞的情况下确定细菌ATP的方法中使用，该方法中，首先选择性裂解哺乳动物细胞，然后用腺苷三磷酸双磷酸酶降解胞外ATP，使细菌ATP不受影响。反应完成后，可以灭活腺苷三磷酸双磷酸酶，使细菌细胞的胞内ATP释放出来，以便通过加入荧光素/荧光素酶来测量细菌ATP。在加入已知量的ATP标准品之前和之后测量发光，作为内部对照。通过将加入ATP标准品之前和之后的光比率乘以所加的标准品的量来计算细菌ATP(以摩尔计)。通常，细菌细胞每个细胞含有约1个阿托摩尔的ATP，从而可以根据所检测的ATP的量估计细菌细胞的数量。本发明的一个目的是提供对这种分析和诊断方法的改进。

在本文中，最常用的腺苷三磷酸双磷酸酶是马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶(STA；通常称为马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶，SEQ ID NO:9)。STA存在多种同工型，每种同工型在ATP降解活性方面各有不同。然而，在使用STA时，上述方法中STA的效率受限于降解反应中ADP和不典型ATP类似物的蓄积。这种污染物的蓄积抑制了ATP降解性能，从而使一些污染性ATP保持完整，而这又限制了ATP检测分析的灵敏度，还增加了背景信号。关于STA限制的讨论，见专利WO199402816。

此外，DNA测序方法焦磷酸测序的大多数实施例(见例如，国际专利申请PCT/GB1997/002631和PCT/GB1997/003518，或美国专利申请US2013/0045876和US2013/0189717)也依赖于ATP的定量，ATP的定量通常利用荧光素酶/荧光素分析法。每个测序循环结束时，所有未结合的核苷酸和过量的ATP必须使用例如腺苷三磷酸双磷酸酶来消除。如上所述，目前用于DNA测序应用的腺苷三磷酸双磷酸酶存在以下问题：由于酶的质量(NDP激酶的污染)，底物特异性以及批间差异不能实现完全降解，这不仅导致下降峰和非线性峰，也影响长链的DNA测序。本发明的一个目的是更好地消除ATP，其类似物以及其它二磷酸核苷酸或三磷酸核苷酸，以例如实现DNA测序改进。

术语释义

以下术语和词语在本说明书的上下文中具有如下所定义的含义。

词语“包括”或“包含”将以非限制性方式来解释，例如包括或包含；具有作为部分。

弗氏志贺菌(Shigella flexneri)腺苷三磷酸双磷酸酶(SFA)被定义为具有任何合适纯度的，来自弗氏志贺菌的腺苷三磷酸双磷酸酶。SFA可以通过非重组方法或通过重组DNA技术生产。本文中，重组弗氏志贺菌(Shigella flexneri)腺苷三磷酸双磷酸酶缩写为rSFA。天然SFA的序列为SEQ ID NO:10。所定义的SFA的腺苷三磷酸双磷酸酶活性与序列为SEQ ID NO.4或序列为SEQ ID NO:10的SFA基本相似。腺苷三磷酸双磷酸酶活性是指将核苷三磷酸催化水解为核苷二磷酸，并将核苷二磷酸水解成核苷单磷酸的能力。