[发明专利]用于对核酸探测并作图的RNA-引导的系统

说明书

使用引导RNA和Cas9蛋白提供对靶核酸的检测、探测、作图和定向测序的方法。提供了检测引导RNA/Cas9复合物与靶核酸的结合的方法，其中引导RNA包含可与探针杂交的3’尾序列。提供了检测引导RNA/Cas9复合物与靶核酸结合的方法，其中物理检测该复合物。

相关申请信息

本申请要求于2014年8月19日提交的美国临时专利申请62/039,341号的优先权，其通过引用其全文纳入本文用于所有目的。

背景技术

细菌和古细菌CRISPR-Cas系统依赖于与Cas蛋白负荷的短引导RNA以引导入侵外来核酸内存在的互补序列的直接降解。参见Deltcheva，E.等，通过反式编码小RNA和宿主因子RNA酶III的CRISPR RNA突变(CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNAand host factor RNase III).Nature 471，602-607(2011)；Gasiunas，G，Barrangou，R.，Horvath，P.和Siksnys，V.Cas9-crRNA核蛋白蛋白复合物介导细菌的获得性免疫的特异性DNA切割(Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavagefor adaptive immunity in bacteria).Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 109，E2579-2586(2012)；Jinek，M.等，获得性细菌免疫中可编程的双RNA-引导的DNA内切核酸酶(A programmable dual-RNA-guidedDNA endonuclease in adaptive bacterial immunity).Science 337，816-821(2012)；Sapranauskas，R.等，嗜热链球菌CRISPR/Cas系统提供大肠杆菌中的免疫(TheStreptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichiacoli).Nucleic acids research 39，9275-9282(2011)；和Bhaya，D.，Davison，M.和Barrangou，R.细菌和古细菌中的CRISPR-Cas系统：获得性防御和调节的通用小RNA(CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea：versatile small RNAs for adaptivedefense and regulation).Annual review of genetics 45，273-297(2011)。最近的酿脓链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR系统的体外重建证明与正常反式编码tracrRNA融合的crRNA(“CRISPR RNA”)(“反式-作用CRISPR RNA”)足够引导Cas9蛋白序列特异性切割匹配cdRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9招募以及靶DNA降解。参见H.Deveau等，对嗜热链球菌中CRISPR编码的抗性的噬菌体响应(Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus).Journal of Bacteriology190，1390(2008年2月)。已知CRISPR/Cas9系统的各种用途。参见WO2014/099744、WO2013176772、US 8,697,359和Sternberg等，Nature，第507卷，第62-67页(2014)。

发明概述