[发明专利]制备胚状体形成用容器的方法

说明书

本发明的目的在于提供一种制备胚状体的形成性优异、适合光学观察的胚状体形成用容器的方法。本发明的发明人们发现，通过经过以特定量将侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物赋予于容器内面，使其干燥，形成涂布膜；之后通过特定量的处理液将涂布膜流平，这样的两个工序，能够制备有效地形成胚状体、且光学观察性优异的胚状体形成用容器，从而完成本发明。

技术领域

本发明涉及一种制备形成胚状体时使用的胚状体形成用容器的方法。

本申请请求通过参照而被引用于此的日本申请特愿2014-224752号的优先权。

背景技术

胚胎干细胞及成体干细胞等干细胞具有在试管内分化为各种细胞的能力。作为使干细胞在试管内分化的方法，利用以下方法：通过对干细胞进行悬浮培养，以形成被称为胚状体的疑似胚体的方法；共同培养像基质细胞那样支持分化与增殖的细胞和干细胞的方法。其中，悬浮培养为在使干细胞在试管内分化时最广泛使用的方法。例如，鼠胚胎干细胞通过在不加入LIF(白血病抑制因子：leukemia inhibitory factor)的情况下，在培养皿等培养容器中，以不粘合的方式悬浮培养而形成细胞团块(細胞塊)。悬浮培养中所形成的细胞团块被称为胚状体(EB)。已知所得到的细胞团块之后分化为各种种类的细胞。

胚状体(EB)具有由两层细胞层构成的如球状的结构，外层相当于近端内胚层、内层相当于胚体外胚层。两个胚层通过基底膜而被隔开。胚状体的结构与作为鼠的6日胚胎的圆筒胚非常相似，在其极限内接近于胚胎的正常的发育阶段。在胚状体中，也会导致中胚层的诱导，还会发育心肌细胞、血液细胞，进一步会发育原始的血管网。此外，若使胚状体附着于培养皿，继续进行培养，则分化为各种种类的细胞。例如，包括神经细胞、角蛋白细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。经过胚状体的形成而分化的细胞，不限于体细胞，最近确认到还会发生向生殖细胞谱系的分化。为了利用干细胞的多分化能，最好形成胚状体。

通常，作为形成细胞团块的技术，已知有在垂下的液滴中培养细胞的悬滴(Hanging drop)法、非专利文献1中记载的回转培养法及离心法。然而，这些方法的培养条件的设定较为烦杂。

专利文献1中，作为用于形成细胞团块的容器，公开了一种利用聚甲基丙烯酸羟乙酯或乙烯-乙烯醇共聚物等而形成的培养容器。

此外，专利文献2中，公开了一种对作为干细胞的一种的ES细胞进行悬浮培养而形成胚状体的方法。在专利文献2的形成胚状体的方法中，使用了以具有磷酸胆碱类似基团的聚合物包覆的胚状体形成用容器。专利文献2中虽然公开了一种用于通过该聚合物包覆胚状体形成用容器的方法，但并未进行详细的研究。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开平6-327462号公报

专利文献2：国际公开第2005/001019号手册

非专利文献

非专利文献1：Biotechnol.J.2008,3,1172-1184

发明内容

本发明要解决的技术问题

以具有磷酸胆碱类似基团的聚合物包覆的胚状体形成用容器，存在由于涂布斑点导致细胞粘合性产生偏差的问题；或涂布膜厚较高时，在容器上产生涂布膜的图案，导致在确认胚状体的形成等的显微镜观察时，背景中拍摄到图案的问题。即，在以具有磷酸胆碱类似基团的聚合物包覆的胚状体形成用容器中，在胚状体形成及从胚状体分化的细胞的光学观察时存在问题。本发明的目的在于，解决该以往的胚状体形成用容器的问题。因此，本发明的目的在于，提供一种胚状体的形成性优异的、适合光学观察的胚状体形成用容器的制备方法。

解决技术问题的技术方法