[发明专利]产生3-羟基丙酸的重组酵母和使用其产生3-羟基丙酸的方法

说明书

本发明提供了产生3‑羟基丙酸(3‑HP)的重组酵母以及使用其产生3‑HP的方法，更具体地，本发明提供了一种产生3‑HP的重组酵母，该重组酵母包含外源AADH基因、内源ACC基因或外源ACC基因、外源MCR基因和外源HPDH基因，并通过[丙酮酸→乙醛→乙酰辅酶A→丙二酰辅酶A→丙二酸半醛→3‑HP]生物合成途径产生3‑HP；以及使用该重组酵母制备3‑HP的方法。

技术领域

本发明涉及产生3-羟基丙酸(3-HP)的重组酵母和使用其产生3-HP的方法，更具体地，涉及产生3-HP的重组酵母，其包含编码AADH的外源基因、编码ACC的内源基因或外源基因、编码MCR的外源基因和编码HPDH的外源基因，并通过[丙酮酸(Pyruvate)→乙醛→乙酰辅酶A→丙二酰辅酶A→丙二酸半醛→3-HP]的生物合成途径产生3-HP，以及使用该重组酵母产生3-HP的方法。

背景技术

3-HP(3-羟基丙酸，C3)是乳酸(2-羟基丙酸)的异构体，在其两端具有羧酸基和羟基，因此是能够转化成各种化学品(如1,3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酰胺、聚合物等)的有用材料。实际上，由于上述原因，2004年3-HP被美国能源部选为能够由生物质生产的有前途的化学品之一。特别地，作为用于涂料、粘合剂、添加剂、尿布等的高度市场化的材料，丙烯酸是3-HP的主要应用形式。3-HP理论上可以通过发酵从诸如葡萄糖的各种生物质中以100％的收率生产，使用微生物的发酵工艺适合于满足对生态环境友好和可再生材料的需求。

还没有利用生物质商业生产3-HP的情况，但已经对各种方法进行了研究，获得经济的3-HP产生菌株成为主要障碍。细菌被公认为是产生有机酸的代表性微生物，并广泛用于工业如食品工业等。然而，将使用工业细菌(如大肠杆菌)的有机酸生产应用于大规模化学工业(如3-HP生产)存在缺点。随着有机酸的产量增加，氢化形式的酸增加，酸性增加(pH降低)，从而大多数大肠杆菌的活性降低。在生产高浓度的有机酸的情况下，细菌需要碱如氢氧化钠(NaOH)和氢氧化铵(NH₄OH)来保持中性pH。这导致依赖于注入的碱的发酵过程的成本增加，使提取和分离过程难以进行或者使成本显著增加。

在最近的将有机酸生产应用于化学工业的情况中，使用酵母从葡萄糖生产有机酸。与细菌相比，酵母对有机酸具有高耐受性，因此即使在高酸性(低pH)下酵母的活性也不会被显著抑制，使得酵母成为更合适的用于生产有机酸的宿主。特别地，酵母已经被常规地、广泛地用作用于生产烈酒、工业乙醇等的工业生物催化剂，酵母可以被大规模地培养并且可以不被噬菌体污染，使得酵母与细菌相比在化学工业中的适用性更加优异。酵母具有产生有机酸的优点，但是使用酵母产生有机酸如3-HP存在几个缺点。首先，与细菌相比，对酵母进行基因修饰更为困难，为了表达特定的代谢酶，应当鉴定用于表达代谢途径以及特定代谢酶的亚细胞位置，这是由于其细胞形状与细菌不同，被分为细胞内结构体，例如线粒体、过氧化物酶体等。例如，代表性代谢中间体如乙酰辅酶A主要在酵母的线粒体中产生。然而，如果在胞质溶胶中产生目标产物，则也需要在胞质溶胶中产生乙酰辅酶A的方法。此外，由于在真菌界存在大量不同的酵母，并且所有酵母都不满足对高生产率、耐有机酸性和大规模培养的要求，因此应当有效地选择适于产生有机酸的宿主。

已知一些酵母有效地从作为己糖的葡萄糖产生乙醇，一些酵母种类也产生有机酸。在进行修饰以使用微生物产生目标产物时，重要的是保持代谢反应的氧化和还原的整体平衡，并且由葡萄糖发酵生产乙醇的代谢反应是得到适当维持的反应。即使在基因修饰酵母以产生有机酸的情况下，也应当适当地保持上述平衡，并且在通过修饰酵母来生产乳酸的情况下，平衡地引入另一还原反应的乳酸脱氢酶(LDH)用于补充从乙醛生产乙醇的还原反应是重要的。