[发明专利]多核苷酸文库的重组酶介导的整合

权利要求书

1.用于使用位点特异性重组酶将感兴趣的多核苷酸文库整合到丝状真菌宿主细胞的染色体中的一种方法，从而实现高度一致的表达水平，所述方法包括以下步骤：

a)提供丝状真菌宿主细胞，它按以下顺序在其染色体中包含：

i)该重组酶的第一识别序列或在整合位点的5’或3’的区域；

ii)第一选择标记；

iii)该重组酶的第二识别序列；以及

iv)非功能部分第二选择标记；

b)用核酸构建体转化所述宿主细胞，该核酸构建体按以下顺序包含：

i)该重组酶的第一识别序列或在整合位点的5’或3’的区域；

ii)感兴趣的多核苷酸文库；

iii)非功能部分第二选择标记；和

iv)该重组酶的第二识别序列；

c)在所述宿主细胞中表达编码该位点特异性重组酶的基因；和

d)选择转化的宿主细胞，该宿主细胞表达该第二选择标记，而不是该第一选择标记，

其中这一感兴趣的多核苷酸文库是通过该重组酶位点特异性地以正确的方向整合到该宿主细胞的染色体中，由此，从该染色体切离该第一可选择标记，并且由此非功能部分第二可选择标记被重组，以形成该染色体中的功能第二选择标记。

2.如权利要求1所述的方法，其中该多核苷酸文库包括编码感兴趣的多肽的变体的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述感兴趣的多肽是一种酶。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述感兴趣的多肽是一种水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述感兴趣的多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。