[发明专利]变体硫酯酶及使用方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年7月24日提交的美国临时申请号62/028,641的权益，出于所有目的将该文献通过引用以其全文结合在此。本申请在技术上与2014年1月29日提交的并且名称为“变体硫酯酶及使用方法(Variant Thioesterases and Methods of Use)”的PCT/US 2014/013676的主题相关，该文献通过引用以其全文结合在此。

发明领域

本发明涉及变体酰基-ACP硫酯酶以及其在产油细胞中的用途，例如以增加对某些酰基-ACP底物的酶活性并且促进增加具有所希望的脂肪酸谱的油的产生。

发明背景

当今，显著地除了通过微生物发酵商业生产ω-3脂肪酸用于婴幼儿配方奶粉及营养补充剂中之外，脂肪和脂肪酸主要来自植物和动物来源。然而，在使用重组微藻商业生产定制油的方向上正取得进展。参见PCT公开物WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410、WO 2011/150411、以及国际专利申请PCT/US 12/23696。

用于在产油生物体中生产所希望的脂肪酸谱的一种方法是引入酰基-ACP硫酯酶转基因；例如来自产生所希望的脂肪酸的植物的转基因。

通过终止脂肪酸生物合成，该酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)在功能性地决定了该脂肪酸最终产品的长度和一致性(萨拉斯(Salas)等人，(2002)《生物化学与生物物理集刊》(Archives of Biochemistry and Biophysics)403:25–34)。基于氨基酸序列比对，这些植物TE已经显示集群至两个家族：FatA，其显示显著的对于18:1-ACP的偏爱，它对于18:0-和16:0-ACP具有较小活性；和FatB，其主要水解具有在8–16个碳之间变化的链长度的饱和酰基-ACP(尔克(Voelker)，在《基因工程》(Genetic Engineering)第18卷.由塞特洛(Setlow)JK.编辑纽约，纳姆出版社(Plenum Press)；1996:111-133中；吉娜斯基(Ginalski)，等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)(2003)31:3291-3292；以及琼斯(Jones)，等人，(1995)《植物细胞》(Plant Cell)7:359–371)。FatB TE具有一个保守的疏水性18-氨基酸结构域(法茨乔蒂(Facciotti)和袁(Yuan)(1998)《欧洲脂质科学与技术杂志》(European Journal of Lipid Science and Technology)100:167–172)，以及一个在C-末端催化结构域中的保守的Asn-His-Cys催化三联体(布拉蒂(Blatti)，等人，《公共科学图书馆·综合》(PLoS ONE)(2012)7(9):e42949.doi:10.1371以及迈尔(Mayer)和尚克林(Shanklin)，《BMC植物生物学》(BMC Plant Biology)(2007)7:1-11)。迈尔(Mayer)和尚克林(Shanklin)，《BMC植物生物学》(BMC Plant Biology)(2007)7:1-11，鉴定以包含Cys-His-Asn催化三联体的C-末端热狗式折叠(hot dog fold)为特征的C-末端保守的酰基-ACP硫酯酶催化结构域。

概述

提供了非天然蛋白质，编码该非天然蛋白质的分离的基因，表达该非天然蛋白质的表达盒，或包括该表达盒的宿主细胞。在一些实施例中，该非天然蛋白质与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性，并且在对应于SEQ ID NO:1的位置163的位置处包括酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)，和/或在对应于SEQ ID NO:1的位置186的位置处包括脯氨酸(P)、赖氨酸(K)、或丙氨酸(A)。在一些实施例中，该非天然蛋白质进一步地在对应于SEQ ID NO:1的位置228的位置处包括赖氨酸(K)。