[发明专利]用于使用H1启动子表达CRISPR向导RNA的组合物和方法

权利要求书

1.包含载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含双向启动子，其中所述双向启动子包含：

a) 控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和

b) 控制元件，其提供编码Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，

其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达；

其中所述双向启动子包含双向H1启动子；并且其中将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。

2.权利要求1的系统，其中所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。

3.权利要求1的系统，其中将所述Cas9蛋白针对所述细胞中的表达进行密码子优化。

4.权利要求1的系统，其中所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。

5.权利要求1的系统，其中所述细胞是真核细胞。

6.权利要求5的系统，其中所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。

7.权利要求5的系统，其中所述真核细胞是视网膜感光细胞。

8.权利要求1的系统，其中所述一种或多种基因产物是视紫红质。

9.权利要求1的系统，其中所述一种或多种基因产物的表达减少。

10.改变细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含含有双向启动子的载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，其中所述双向启动子包含：

a) 控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交；和

b) 控制元件，其提供编码Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，

其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变所述细胞中的一种或多种基因产物的表达；

其中所述双向启动子包含双向H1启动子；并且其中将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。

11.权利要求10的方法，其中所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。

12.权利要求10的方法，其中将所述Cas9蛋白针对所述细胞中的表达进行密码子优化。

13.权利要求10的方法，其中所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。

14.权利要求10的方法，其中所述细胞是真核细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。

16.权利要求14的方法，其中所述真核细胞是视网膜感光细胞。

17.权利要求10的方法，其中所述一种或多种基因产物是视紫红质。

18.权利要求10的方法，其中所述一种或多种基因产物的表达减少。