[发明专利]分析物的提取、衍生化和定量

说明书

本申请根据U.S.C.§1 19(e)要求2014年5月30日提交的美国临时申请62/005,676的优先权，其全部内容被明确纳入本文作为参考。

需要获得快速，流水线化且自动化检测特定分析物的方法。在医学环境中，这样的方法将促进诸如药物、激素、信号传导试剂和氨基酸等分析物的检测。在农业和公众健康的情况下，抗生素、杀虫剂或其它污染物的残留水平的检测也是我们食用的食物和饮用的水的安全性中不可或缺的部分。此外，近来食品标签标准的变化，例如"无激素"或"有机"也导致了农业领域中流线测试的需要。

儿茶酚胺是维持人体健康状态重要的必需激素或神经递质。神经疾病(例如帕金森氏病或阿尔茨海默病)常常改变血液中这些物质的水平。变肾上腺素类(儿茶酚胺的衍生物)水平升高可指示某些癌症，例如嗜铬细胞瘤的发生。类似地，变肾上腺素类(变肾上腺素和去甲变肾上腺素(normetanephrine))，甲状腺激素(甲状腺素T4，3,5,5'-三碘甲腺原氨酸T3，和3,3',5-三碘甲腺原氨酸rT3)，雌激素(雌酮、固醇、雌二醇和雌三醇)，δ-9-四氢大麻酚(THC)，其衍生物和代谢产物等，是对于临床医师确定患者状态来说重要的许多其他生物学有意义的分析标记物。

传统上，经由放射免疫分析(RIA)来进行儿茶酚胺的临床定量。近年来，由于质谱领域的技术进步，测试平台从RIA逐渐转移至液相色谱质谱(LCMS)。通常，基于LCMS的分析可提供快速、灵敏、分析物特异性读数，这些是RIA分析可能缺少的。然而，儿茶酚胺是难以检测的，因为它们易于被氧化降解。此外，现有技术儿茶酚胺/变肾上腺素的定量常常涉及复杂且繁琐的提取过程，提取回收率不稳定，从而导致结果往往是不可靠的，并且具有高的定量下限(LLOQ)；例如LLOQ＞10ng/mL。而且，现有的提取过程不能提供可靠的样品用于衍生化。

药物包括非法和合法药物及其代谢物或衍生物。检测这些化合物对于法医或处方顺应性是非常重要的。此外，这些药物可能在体液中不稳定，因此检测可能困难。在任何情况下，非常需要一种完全自动化和简化的检测/定量方法，该方法能使人为介入或误差的空间最小。

发明概述

本发明提供了可用于测量生物样品中的儿茶酚胺(多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素)，变肾上腺素类(变肾上腺素和去甲变肾上腺素)，甲状腺激素(T4，T3和rT3)，雌激素(雌酮，雌二醇，雌三醇)，大麻素如δ-9-四氢大麻酚(THC)，5-羟色胺，氨基酸，BPA以及许多其它含伯胺和仲胺、或者含酚的分子的水平的材料和方法。所需分析物可以通过质谱(包括串联质谱技术)选择性地、灵敏地检测和测量。整个定量过程包括样品的制备过程，采用固相提取以捕获分析物，然后进行分析物的化学衍生化，然后通过LC-MS/MS技术定量，如本文所述。

在该工作期间发现，固相提取与Fmoc氯化物的化学衍生化和LC-MS/MS的组合提供血浆/血清样品中10pg/ml或更低的儿茶酚胺水平的分析物特异性、灵敏、准确、稳定且稳健的测量。定量变肾上腺素类和甲状腺激素的方法也被开发成具有相似的灵敏度和准确性。

敏感和准确地测量这些分析物在临床环境相关的水平是有用的，特别是在低皮克/毫升的范围内，在小样本大小(100μl或更少的血浆/血清样品)，用易于配置成自动化的简单方法，且具有分析物特异性结果，而不会产生在其它分析技术，例如放射免疫测定法(RIA)中常见的任何分析物交叉。

附图的简要说明

图1A和1B呈现了实施例数据，显示内标当量100pg(图1A)和儿茶酚胺掺杂的血浆(图1B)的色谱图。

图2A和2B显示了在10和100pg/ml每种儿茶酚胺获得的数据。

图3提供了变肾上腺素类的色谱图：顶部是变肾上腺素(659.210/268.400)，中间是去甲变肾上腺素(645.100/166.100)，下方是变肾上腺素(659.210/268.400)。

图4A,4B,4C,4D和4E显示了变肾上腺素和去甲变肾上腺素中各种位移的图谱。

图5A,5B,5C和5D显示了甲状腺激素每个位移的各个峰：具有5ng/ml当量的血浆(图5A)，血浆空白(图5B)，血浆1ng/ml(图5C)以及含1ng/ml的200μL BSA(图5D)。

图6A,6B和6C显示了甲状腺激素T3在31.3pg/ml(图6A)，rT3在31.3pg/mL(图6B)，T4在31.3pg/ml(图6C)各自的数据。