[发明专利]使用腺病毒载体的体内基因改造

权利要求书

1.一种重组核酸表达盒，其包含至少一个第一核酸模块，其包含：

(i)编码核酸酶的第一编码区，其中所述的核酸酶能够在所关注的CD34+细胞基因组靶物中产生DNA断裂；以及

(ii)编码一个或多个miRNA靶位点的第二编码区，其中所述的miRNA靶位点位于所述的第一编码区的3’非翻译区，并且在所述的第一编码区的翻译终止密码子下游的至少60个核苷酸，其中与所述的一个或多个编码的miRNA靶位点结合的miRNA在病毒生产型细胞中高度表达，但是在CD34+细胞中不表达或以低水平表达，

其中所述的第一核酸模块与在CD34+细胞中具有活性的启动子可操作地连接。

2.权利要求1所述的重组核酸表达盒，其进一步包含编码结合CD46的腺病毒纤维多肽第二核酸模块。

3.权利要求1或2所述的重组核酸表达盒，其进一步包含位于所述的重组核酸载体的各个末端的反向末端重复序列(ITR)，其中所述的ITR衍生自结合CD46的腺病毒血清型。

4.权利要求1-3所述的重组核酸表达盒，其进一步包含得自结合CD46的腺病毒血清型的包装信号。

5.权利要求4的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的一个或多个miRNA靶位点包含选自以下的1个、2个或所有3个miRNA的反向互补序列：(a)CACUGGUAGA(SEQ ID NO:1)(has-miR183-5p核心),(b)UGUGCUUGAUCUAA(SEQ ID NO:2)(has-miR218-5p核心)；和(c)CACUAGCACA(SEQ ID NO:3)(miR96-5p核心)。

6.权利要求1-5的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的一个或多个miRNA靶位点包含选自SEQ ID NO:1-90的miRNA的反向互补序列。

7.权利要求1-6的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的第二编码区编码至少4个miRNA靶位点。

8.权利要求1-7的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中1-10个核苷酸的间隔序列存在于各个编码的miRNA靶位点之间。

9.权利要求1-8的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN),转录激活因子样效应器核酸酶(TALEN),巨核酶和CRISPR-Cas9核酸酶。

10.权利要求1-9的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的核酸酶包含多肽的氨基酸序列，其中所述的多肽选自SEQ ID NO 91-93和103。

11.权利要求1-10的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的核酸酶能够在CD34+细胞基因组靶物中产生DNA断裂，其中所述的CD34+细胞基因组靶物选自编码趋化因子受体5型(CCR5),β-球蛋白,补体受体2(CR2)(人类疱疹病毒(EBV)受体),Niemann-Pick病,C1型受体((NPC1)埃博拉病毒受体),血管紧张素转化酶2受体((ACE2)SARS受体)的基因，以及编码如果误叠能够导致溶酶体贮积症的蛋白质的基因。

12.权利要求1-11的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的启动子选自EF1α启动子,磷酸甘油酸激酶(PGK)1启动子和泛素基因启动子。

13.权利要求2-12的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含与CD46结合的一个或多个人类腺病毒钮结构域或其功能等价物。

14.权利要求13所述的重组核酸表达盒，其中所述的钮结构域选自Ad11钮结构域,Ad16钮结构域,Ad21钮结构域,Ad35钮结构域,Ad50钮结构域及其功能等价物。

15.权利要求13或14所述的重组核酸表达盒，其中所述的钮结构域选自SEQ ID NO:94-101。

16.权利要求2-15的任意一项所述的重组核酸表达盒，其中所述的第二核酸模块编码腺病毒纤维多肽，其包含一个或多个人类腺病毒柄结构域或其功能等价物。