[发明专利]用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法

说明书

本申请涉及用于使多能干细胞(PSC)分化为心肌细胞的方法。此外，本申请涉及用于使人胚胎干细胞(hESC)和诱导型多能干细胞(iPSC)分化为确定的心肌细胞的方法，其基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤。

技术领域

本申请涉及用于使多能干细胞(PSC)分化为心肌细胞的方法。此外，本申请涉及用于使人胚胎干细胞(hESC)和诱导型多能干细胞(iPSC)分化为增殖心肌细胞的方法，该方法基于化学成分确定的培养基诱导的连接步骤。

背景技术

许多年以来，多种细胞培养系统已用于临床前药物开发。但是，已建立的细胞模型仅部分反映药物相关疾病特异性生理学，因为它们源自致瘤组织或源自转化和无限增殖化细胞。具体而言，因为终末分化的心肌细胞显示具有有限的增殖潜能，所以它们不具有有效产生用于药物开发的细胞模型的能力。因此，存在对可在研究和药物开发中用作可靠的细胞模型的更多疾病相关人细胞类型的需要。

人胚胎干细胞(hESC)和诱导型多能干细胞(iPSC)为研究人员提供了产生功能性人细胞类型(如心肌细胞、神经元细胞、胰细胞等)的巨大机会。用于体外分化纯hESC和iPSC来源的人心肌细胞(hESCM)培养物的稳健流程将是强大的工具，不仅增进对早期人心脏发生(cardiogenesis)的理解，还用心肌细胞作为非转化人细胞模型来在药物开发的临床前阶段测试药物功效，及在进入临床之前评估心脏毒性。此外，hESC来源的人心肌细胞为鉴定对心脏再生至关重要的途径打开了机会，并最终导致支持基于干细胞的疗法的临床应用。

为了发展用于药物研究和开发的细胞测定模型，这类分化流程需产生理想地满足以下标准的细胞：a)稳健，具有高水平的可重复性；b)产生大量高度纯化的细胞类型；c)可在短时间内分化；d)产生可冷冻的细胞，以保证多种筛选活动的批次一致性；e)提供功能性和生理学相关性用于模拟疾病特异性读出。P.W.Burridge等综述了使多能细胞分化为心肌细胞的现有技术方法(P.Burridge,Keller,Gold,Wu,2012)。迄今没有一种已知的流程满足以上标准。具体而言，通过已知流程获得的心肌细胞难以冷冻和解冻而不丧失任何功能特性。

为了满足这些需要，我们发展了产生大量高度纯化的心肌细胞(至多95％)的新的分化方法。该分化流程是用确定的小分子来在10天的时间跨度内指导向心肌细胞系分化。为了进一步提高其纯度，通过用心肌细胞偏好的条件重新接种(replating)它们来富集心肌细胞。此外，随后可以冷冻心肌细胞，在液氮下保存，并再次解冻。已测试该心肌细胞符合几种用于药物研究和开发的筛选型式。本发明提供与现有技术流程相比在较短时间内和以显著提高的产率使多能干细胞分化为心肌细胞的改进方法。该新方法减轻了从多能干细胞获得拟胚体或小细胞团的必要性，并去除了迄今已知的方法的低可重复性和标准化的主要缺点。此外，高效率允许在药物产业中将这些确定的心肌细胞大规模用于药物发现和安全性评估、用于再生医学应用及用于体外疾病模拟。

发明概述

1.本文提供用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法，该方法包括步骤：

a)提供密度为3-7x10⁵/cm²的多能干细胞；

b)在含有下式的化合物的无胰岛素培养基中孵育该细胞：

在一个实施方案中，在含0.3-10μM该化合物的无胰岛素培养基中孵育该细胞。

在一个实施方案中，步骤b)包括孵育该细胞12-48小时。

在一个实施方案中，该方法还包括步骤c)在含Wnt-C59的无胰岛素培养基中孵育该细胞。

在一个实施方案中，步骤c)包括在含1-10μM Wnt-C59的无胰岛素培养基中孵育该细胞。

在一个实施方案中，步骤c)包括孵育该细胞24-72小时。