[实用新型]一种用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器

说明书

技术领域

本实用新型属于分析化学与电化学传感器领域，涉及一种基于纳米金 (AuNPs)和石墨烯(Graphenesheets，GS)联合修饰并包被有链霉亲和素的丝 网印刷电极的电化学免疫传感器，可对血清中人附睾蛋白4(Human epididymis-specificprotein4，HE4)浓度进行检测，用于早期诊断卵巢癌。

背景技术

HE4首先在附睾远端的上皮中被发现，并且最初认为它是一种与精子成熟相 关的蛋白酶抑制剂。一直以来有报道认为HE4在卵巢癌组织的上皮内有所表达。 不仅在细胞水平上有所表达，分泌型HE4已经在卵巢癌患者的血清中检测到有 高水平表达。在卵巢癌患者与良性状态下的健康者的病例/对照对比性研究中发 现HE4检测卵巢癌在特异性水平为96％时具有67％的敏感性。在对卵巢癌相关 的大量生物标志物的评价研究中，HE4在疾病的早期阶段检测卵巢癌时具有最 高的灵敏度。因此，对HE4进行检测对卵巢癌的早期的诊治预防具有重要意义。

目前，血清HE4测定可用酶联免疫吸附试验和化学发光免疫检测法，这两 种方法需要实验室大型仪器检测并需配备专业人员，且检测时间相对较长。

发明内容

本实用新型的目的在于提供一种用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器， 该传感器可快速检测早期卵巢癌患者的HE4浓度，且操作简单、检测成本低廉。

本实用新型的用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器，在基底层上依次有 电极层和绝缘层，电极层为由工作电极、参比电极和对电极构成的三电极体系， 绝缘层覆盖在电极层上使三电极一端裸露用于检测，在绝缘层上还开有凹槽， 凹槽处三电极裸露，在凹槽内工作电极表面自下而上依次覆盖有石墨烯-纳米金 膜、链霉亲和素层、生物素化的HE4一抗层、HE4抗原层以及辣根过氧化物酶 标记二抗层。

上述技术方案中，所述的基底层通常为PET基板或硅片。

所述的对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极，工作电极是碳电极。 所述的石墨烯-纳米金膜是采用将混合均匀的石墨烯-纳米金-DMF分散液进行滴 加并烘干制得，膜中石墨烯与纳米金的质量比为1:1。

所述的绝缘层可以为环氧树脂。

上述用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：

a)用超纯水、无水乙醇清洗基板表面。使用丝网印刷工艺，将电极层、绝 缘层依次印在基板上，使电极层一端裸露，同时使绝缘层上开有凹槽，凹槽内 三电极裸露；90℃真空干燥箱内干燥处理15min后待用；

b)将石墨烯和纳米金溶液均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液(DMF)中， 超声处理10min，制成石墨烯-纳米金DMF分散液，其中石墨烯与纳米金质量 比1:1；

c)取上述分散液均匀滴涂于凹槽内的工作电极上，室温下干燥2h，制成 GS-AuNPs/SPE电极；

d)取链霉亲和素溶液滴加于上述GS-AuNPs/SPE电极的石墨烯-纳米金粒子 复合膜上，利用纳米粒子吸附性强的特性将链霉亲和素固定在丝网印刷电极上；

e)将生物素化的HE4抗体滴加到凹槽内工作电极上，室温孵育1小时后， 用冲洗液冲去未结合的生物素化的HE4抗体；

f)将HE4标准品滴加到凹槽内工作电极上，室温孵育1小时后，用冲洗液 冲去未结合的HE4标准品；

g)将经辣根过氧化物酶标记的HE4二抗滴加到凹槽内工作电极上，室温孵 育1小时后，加入0.25％的小牛血清蛋白(BSA)封闭抗体的非特异性吸附位点 10分钟，然后用冲洗液冲去未结合的经辣根过氧化物酶标记的HE4二抗；获得 用于检测HE4浓度的电化学免疫传感器。

在上述传感器工作电极表面滴加5μl的过氧化氢溶液，可测定其氧化还原 电位的变化，利用辣根过氧化物酶可催化过氧化氢产生的电流值与HE4的浓度 值呈线性关系，绘制标准曲线。