[实用新型]一种犬细小病毒快速半定量免疫层析检测试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法制备的犬细小病毒快速半定量免疫层析检测试剂盒。

背景技术

犬细小病毒（CanineParvovirus,CPV）是细小病毒属成员，单链小DNA病毒。病毒粒子为等轴对称的二十面体，外观呈圆形或六边形，无囊膜，病毒颗粒直径为21nm～24nm，沉降系数为23S～27S。在1977年，首次从患有肠炎的病犬体内分离获得CPV，病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬的易感性高，可引起幼犬的心肌炎；随后在许多国家和地区的犬科动物中相继被发现，发病率为50%～100%，死亡率为10%～50%，对养犬业和经济动物养殖业危害极大，因此一旦发病，则很难制止传播流行，是对我国养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的疫病之一。因此要建立快速有效的检测方法，并针对该病进行有效治疗。目前国内外已有检测犬细小病毒的试剂盒上市，主要采用酶联免疫法（ELISA）、化学发光法、金标层析法、生物芯片等。

免疫层析胶体金技术作为新型的诊断技术，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成抗原-抗体复合物，然后在硝酸纤维素膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线，在一定的条件下，T线的强弱和样品中的浓度呈正相关或负相关，从而实现检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

发明内容

本实用新型的目的是提供犬细小病毒快速半定量免疫层析检测试剂盒，具有半定量检测能力，操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

为解决上述技术问题，本实用新型一种犬细小病毒快速半定量免疫层析检测试剂盒其特征在于试剂盒的试纸卡主要由样品垫，结合垫，吸水垫，底板，硝酸纤维膜五部分组成。

所述试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴样品垫(2)，样品垫的一端紧密压接含有标记抗犬细小病毒（CPV）特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C(6)，硝酸纤维素膜的另一端连接吸水垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡壳内形成试纸卡。

所述试纸卡的抗体为犬细小病毒（CPV）配对抗体，分别识别CPV不同表位，抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。检测线T为和标记抗体配对的CPV特异性抗体，质控线C为羊抗鼠IgG抗体。

所述试纸卡的样品垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸水垫由吸水滤纸构成。

所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定。不同深浅的红色线条共5条，分别对应5、2.5、1、0.5、0.2ng/ml的CPV浓度。

所述试纸卡，NC膜抗体的包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）将CPV抗体配制成0.4－1.5mg/ml的溶液，将羊抗鼠IgG配制成0.6-1.5mg/ml的溶液，用喷金划膜仪在NC膜上部和下部以1-1.1μl/cm的参数进行分别划线，包被C、T线，划线后将NC膜在干燥间，温度21-25℃，湿度小于30%，干燥时间为2-5h。

所述试纸卡，金标垫的制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30－50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.1MK₂CO₃调至pH8.0左右，按100ml胶体金溶液加入0.4－1.5mg与包被CPV配对的另一CPV抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度为10%牛血清白蛋白，封闭20min，12000r/m离心20分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度21-25℃，湿度小于30%，干燥2-5h，制成金标垫。

所述试纸卡的装配过程为：在干燥室内，温度21-25℃，湿度小于40%，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫,搭金标垫的1/5粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3－5mm宽的试纸条，再装入塑料卡壳内，形成试剂试纸卡。