[实用新型]一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用

权利要求书

1.一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法，所述方法包括：

（1）用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养所述消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；

（2）采用脂质体转染法，将编码hTERT和Marker基因的真核表达质粒导入所述原代培养的鸭胚肝细胞；

（3）培养所述转染的鸭胚肝细胞，用G418筛选所述hTERT阳性克隆；

（4）培养筛选的所述hTERT阳性克隆，连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述Marker基因为neo基因。

3.根据权利要求1所述方法制备的一种永生化的鸭胚肝细胞系。

4.一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，所述方法包括：

（1）培养增殖所述永生化的鸭胚肝细胞系；

（2）在培养的所述永生化的鸭胚肝细胞系中接种鸭病毒性肝炎病毒，培养增殖所述鸭病毒性肝炎病毒；

（3）收获所述培养的鸭病毒性肝炎病毒，灭活。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。

6.根据权利要求4～5任一项所述方法制备的鸭病毒性肝炎疫苗。

7.一种测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价的方法，所述方法包括：

（1）将权利要求1所述的鸭肝细胞系接种于细胞瓶中，待长满单层后，传代于96孔板中，每孔1.5～2.0×10⁵个细胞，继续培养；

（2）将鸭病毒性肝炎病毒稀释成100TCID₅₀/1.0ml，与等量的2倍系列稀释的被检卵黄抗体混合，反应；

（3）反应结束后，每一稀释度接种1列（8个孔）长满所述的鸭胚肝细胞的96孔板，置于37℃CO₂培养箱中继续培养，同时设阴性和阳性对照；

（4）接种后3～4天，记录每个稀释度出现细胞病变（CPE）的孔数，计算所述卵黄抗体的中和效价。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤（2）中所述鸭病毒性肝炎病毒为DHV-1-LY株。

9.根据权利要求3所述永生化的鸭胚肝细胞系在制备鸭病毒性肝炎疫苗、测定鸭肝炎病毒卵黄抗体效价中的应用。