[发明专利]一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法

权利要求书

1.一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于包括以下步骤：

1)巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)CALB产南极假丝酵母脂肪酶B，具体方法如下：先将巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)CALB进行斜面种子培养、活化种子培养和一级种子培养，然后再接入含BSM培养基的发酵罐中发酵培养，获得南极假丝酵母脂肪酶B；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)CALB，已于2015年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCCNO.10277；

2)脂肪酶的固定化，具体方法如下：将预处理后的树脂加入含有南极假丝酵母脂肪酶B发酵液的发酵罐，使树脂处于悬浮状态下吸附；

3)固定化酶的处理，具体方法如下：将步骤2)中吸附后的树脂筛出，水洗，冷冻干燥。

2.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤1)中，所述斜面种子培养的具体方法为：从甘油管中接500～1000μL菌液至斜面种子培养基中；所述斜面种子培养基为YPD琼脂培养基，所述YPD琼脂培养基的组成可为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，琼脂粉15g/L。

3.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤1)中，所述活化种子培养的具体方法为：使用接种环将斜面种子培养基中的菌液刮取一环接至活化种子培养基中；所述活化种子培养基为YPD培养基，所述YPD培养基的组成可为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L。

4.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤1)中，所述一级种子培养的具体方法为：从活化种子接1％～10％菌液至一级种子培养基中，所述一级种子培养基为YPD培养基。

5.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤1)中，所述接入含BSM培养基的发酵罐中培养是从一级种子接1％～10％发酵液至发酵罐BSM培养基中；所述BSM培养基的组成可为：甘油：40gL^-1；H₃PO₄：26.7mLL^-1；CaSO₄·2H₂O：0.93gL^-1；K₂SO₄：18.2gL^-1；MgSO₄·7H₂O：14.9gL^-1；KOH：4.13gL^-1；由28％NH₄OH调整pH到4.0～6.0：含4mLL^-1的PTM1。

6.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤1)中，所述发酵培养的条件为：温度20～40℃，转速300～900rpm，通气量1～5vvm，pH通过氨水控制于pH4.0～7.0，发酵进行至20～24h时，补加50～200ml50％的甘油作为碳源，发酵进行至40～48h时，将温度控制为15～25℃，同时开始每24h流加150～200mL甲醇，120～144h后停止发酵。

7.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤2)中，所述树脂采用HPD826型大孔吸附树脂。

8.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤2)中，所述将预处理后的树脂加入含有南极假丝酵母脂肪酶B发酵液的发酵罐是将预处理后的HPD826树脂以体积比1∶(10～50)加入发酵罐中；发酵罐中CALB的酶活浓度可为50～120U/mL。

9.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤2)中，所述吸附的条件为温度15～35℃，通气量1～6vvm，转速100～600rpm，使树脂处于悬浮状态下；吸附的时间为10～24h。

10.如权利要求1所述一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于在步骤3)中，所述将步骤2)中吸附后的树脂筛出是将含有树脂的发酵液用20～100目的标准分子筛筛出其中的树脂；所述水洗可采用去离子水洗3次；所述冷冻干燥的时间可为24～48h。