[发明专利]一种乌拉立肽的制备方法

说明书

本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种乌拉立肽的制备方法。本发明根据乌拉立肽的肽序结构，采用特定的保护的丝氨酸二肽作为原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。根据实验，本发明精肽收率可高达38.4％～41.1％，优于顺序逐个偶联方法(约15.2％)及片段合成方法(约23.2％)。同时，本发明精肽的纯度为99.3％。在保证了纯度的同时保证了收率。

技术领域

本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种乌拉立肽的制备方法。

背景技术

乌拉立肽是32个氨基酸残基组成的促尿钠排泄环肽，其结构如式I：

乌拉立肽最初是在1988年由Schulz-Knappe等从尿液中分离得到的一种属于心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)家族的肾利钠肽。内源性乌拉立肽在肾远端肾小管细胞合成，由管腔后分泌，在内部髓集合管与下游利钠肽A型受体结合，能够调节肾脏钠和谁的排泄，因此，乌拉立肽有舒张血管和利钠利尿的作用，并且以证实乌拉立肽能够降低肾脏对尿液的重吸收。

国外对乌拉立肽的研究已进入二期临床，结果表明，乌拉立肽能够降低心脏充盈压力和改善呼吸困难，且对DHF患者的肾脏功能没有明显的不良影响，可见，乌拉立肽在治疗DHF中有广阔前景。

目前一种比较流行的合成乌拉立肽的方法是固相逐步合成(SPPS)法，该方法具有操作简单、设备要求低等特点。但是因为乌拉立肽由32个氨基酸组成，固相逐步合成法的产品收率低，肽段容易卷曲，反应位点不易暴露，得到的乌拉立肽粗肽纯度低，杂质繁杂，致使产品纯化困难，不易得到高纯度的乌拉立肽，总收率低。

另外，对于解决偶联困难的氨基酸的问题，片段合成法是一种常用的手段。片段合成法是先将偶联困难的序列制备成全保护肽，将其作为一个整体直接偶联到指定肽树脂上，从而可以跳过偶联困难的氨基酸，避免逐个氨基酸偶联产生的缺损等副反应，能够获得纯度相对高的粗肽产品。但片段合成法采用了常规的树脂外，还需使用大量价格较昂贵的2-CTC树脂制备片段肽树脂，且2-CTC树脂酸敏感性高，偶联时肽容易脱落，从而导致制备的片段收率不高，操作步骤相对繁琐。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种乌拉立肽的制备方法，本发明提供的制备方法收率高，产品纯度高。

本发明提供的乌拉立肽的制备方法，包括：

步骤1：固相合成Fmoc-Tyr-树脂；

步骤2：根据乌拉立肽的肽序在所述Fmoc-Tyr-树脂上偶联氨基酸或二肽，制得乌拉立肽树脂；所述二肽选自-Asn-Ser、-Gln-Ser、-Ser-Ser或-Arg-Ser中的任一种或多种；

步骤3：乌拉立肽树脂经裂解获得乌拉立肽线性粗肽；

步骤4：乌拉立肽线性粗肽经环化制得乌拉立肽。

本发明提供的方法将乌拉立肽肽序中第4～5位(-Asn-Ser，记为二肽A)、第10～11位(-Gln-Ser，记为二肽B)、第23～24位(-Ser-Ser，记为二肽C)、第28～29位(-Arg-Ser，记为二肽D)的氨基酸以二肽为原料进行偶联，选用的二肽原料为二肽A～D中任一种或多种，不采用二肽为原料的位点则采用单个氨基酸为原料进行偶联。该方法能够有效防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。