[发明专利]水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条及其制备方法

说明书

水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条及其制备方法，涉及毛皮动物病毒性传染病病原的检测技术领域。本发明的胶体金检测试纸条包括：样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜的检测线上喷涂VP2蛋白，所述NC膜的质控线上喷涂羊抗鼠二抗。本发明的水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条的制备方法，主要包括以下步骤：原核表达水貂细小病毒(MEV)VP2及VP1蛋白及其纯化；水貂细小病毒(MEV)单克隆抗体的制备；胶体金溶液的制备；金标抗体溶液的制备；金标垫的制备；NC膜的预处理；组装。本发明有助于毛皮动物养殖场净化水貂细小病毒性肠炎，方便基层兽医人员的操作。

技术领域

本发明涉及毛皮动物病毒性传染病病原的检测技术领域，具体涉及一种水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条及其制备方法。

背景技术

水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)引起的水貂病毒性肠炎发病率和死亡率高，给养貂业带来了巨大的经济损失。然而本病没有特异的治疗方法，只能采用疫苗免疫来预防，所以对水貂病毒性肠炎的诊断显得尤为重要。目前对MEV的诊断主要是HA-HI和传统PCR方法，HA操作繁琐，耗时费力，而且需要准备猪的红血细胞；而PCR是近些年发展起来的分子生物学诊断方法，主要用于病毒核酸的检测，但是PCR方法需要专业的仪器设备，而且操作人员需要经过专门的培训才能在专门的实验室内操作。

自从1971年Faulk与Taylor创立胶体金标记技术以来，胶体金已成为继荧光标记、酶标记和放射性免疫标记之后的又一种新型的免疫标记技术。胶体金技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，正因为这些特性使它在工作量大、设施较简单的动物检验检疫实际工作中具有很大的实用性，满足了基层兽医检测和大面动物检测需求，所以在兽医传染病上得到了广泛的应用，尤其是病毒性传染病，目前已经在多种动物病毒的检测上应用了本技术。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种快速检测水貂肠炎病毒抗原的胶体金试纸条及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条，包括：样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜的检测线上喷涂水貂细小病毒VP2蛋白，所述NC膜的质控线上喷涂羊抗鼠二抗；所述金标垫的制备方法为：采用20nm胶体金溶液标记水貂细小病毒单克隆抗体获得金标抗体溶液，将其按照6μl/cm的点样量喷涂于玻纤膜上获得金标垫；所述水貂细小病毒单克隆抗体是采用水貂细小病毒VP1蛋白制备的，所述水貂细小病毒VP1蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述水貂细小病毒VP2蛋白浓度为0.85mg/ml，所述羊抗鼠二抗浓度为1mg/ml。

本发明还提供了上述水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、PCR扩增水貂细小病毒MEVB株VP2基因及VP1部分基因，定向克隆至原核表达载体构建重组质粒，并转化至宿主菌BL21中，IPTG诱导后经纯化后得到水貂细小病毒VP2蛋白和水貂细小病毒VP1蛋白；

步骤二、利用纯化的水貂细小病毒VP1蛋白制备水貂细小病毒单克隆抗体；

步骤三、采用柠檬酸还原法制备20nm胶体金溶液；

步骤四、采用20nm胶体金溶液标记水貂细小病毒单克隆抗体获得金标抗体溶液；

步骤五、玻纤膜经预处理后，按照6μl/cm的点样量在玻纤膜上喷涂金标抗体溶液，获得金标垫；

步骤六、将纯化后的浓度为0.85mg/ml的水貂细小病毒VP2蛋白喷涂在NC膜的检测线上，将浓度为1mg/ml的羊抗鼠二抗喷涂在NC膜的质控线上；