[发明专利]一种外周血游离DNA靶向富集的方法及试剂盒有效
| 申请号： | 201511027421.4 | 申请日： | 2015-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN105441426B | 公开（公告）日： | 2018-07-03 |
| 发明（设计）人： | 任绪义;张峰;俞岳峰;吕江峰 | 申请（专利权）人： | 杭州迪安医学检验中心有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 肖明芳 |
| 地址： | 310030 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 游离DNA 外周血 靶向 富集 分子诊断 分子检测技术 选择性去除 大片段DNA 小片段DNA 母体血浆 试剂盒 无创性 胎儿 检测 应用 | ||
1.一种外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，包括如下步骤:
(1)根据目标DNA设计杂交引物，所述的杂交引物用于靶向捕获大片段DNA，所述的杂交引物包括上游杂交引物对和下游杂交引物对，所述的上游杂交引物对和下游杂交引物对分别分布在靶基因扩增片段外侧两端，所述上游杂交引物对和下游杂交引物对的5’端均标记生物素；
(2)提取外周血游离DNA；
(3)将步骤(1)设计的杂交引物与步骤(2)提取的外周血游离DNA混合，加入杂交试剂，使杂交引物与目标DNA结合，得到混合物；
(4)将亲和素标记的磁珠与步骤(3)得到的混合物混合均匀，离心，弃沉淀，上清即为靶向富集后的外周血游离DNA；
所述大片段DNA为碱基数大于1kb的DNA。
2.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(3)中，使富集引物与目标DNA结合的方法为：先在90℃～95℃条件下加热5～10min，再在15～30℃条件下静置5～10min。
3.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的杂交试剂为：Tris-Acetat、MgAc2。
4.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(3)中，杂交引物与目标DNA结合的体系中，杂交引物含量分别为0.05～0.2μmol/L。
5.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(3)中，杂交引物与目标DNA结合的体系中，Tris-Acetat含量为20～40mM，MgAc2含量为2～4mM。
6.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的上游引物对和下游引物对的分别长度为15～39bp，所述的上游引物对和下游引物对在50mM Na+条件下Tm均不小于50℃。
7.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的上游引物对间相距不超过20bp，所述的下游引物对间相距不超过20bp。
8.外周血游离DNA靶向富集与检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
杂交试剂：200mM Tris-Acetat、20mM MgAc2；
亲和素标记的磁珠；
杂交引物：所述的杂交引物用于靶向捕获大片段DNA，所述的杂交引物包括上游杂交引物对和下游杂交引物对，所述的上游杂交引物对和下游杂交引物对分别分布在靶基因扩增片段外侧两端，所述上游杂交引物对和下游杂交引物对的5’端均标记生物素，所述的上游引物对和下游引物对的分别长度为15～39bp，所述的上游引物对和下游引物对在50mM Na+条件下Tm均不小于50℃，所述的上游引物对间相距不超过20bp，所述的下游引物对间相距不超过20bp；
所述大片段DNA为碱基数大于1kb的DNA。
9.根据权利要求8所述的外周血游离DNA靶向富集的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括检测靶基因的引物和检测靶基因的探针。
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