[发明专利]体外诱导人脂肪间充质干细胞向有功能肝细胞分化的方法

权利要求书

1.体外诱导hADSCs向iHeps分化的方法，其特征包括以下步骤：

a、从人的离体脂肪组织中分离出hADSCs；

b、体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下4个阶段：

预处理阶段：在步骤a分离得到的hADSCs中加入含有0.5～2μM ATRA的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基，进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；

内胚层诱导阶段：将预处理后的hADSCs在含有浓度为50～200nM IDE1、1～5μΜCHIR99021和5～20μM LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；

成肝诱导阶段：完成内胚层诱导后的细胞在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002和50～200nM LDN-193189的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中诱导培养36～60小时；接着在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中继续进行诱导培养20～28小时；

肝细胞的成熟阶段：完成了成肝诱导后的细胞在含有浓度为100～200ng/mL肝细胞生长因子(HGF)、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、20～40ng/mL抑瘤素M(OsM)、1.5～3×10^-5mol/L地塞米松(Dex)以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中进行成熟阶段的诱导培养，培养时间为112～144小时；得到由hADSCs分化而来的iHeps细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a述所的hADSCs，采用Ⅰ型胶原酶消化法从人离体脂肪组织中分离所得，其细胞形态为长梭型；步骤b所述的预处理阶段为hADSCs在含有1μΜ ATRA的RPMI-1640培养基中处理24h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述内胚层诱导阶段为将预处理后的hADSCs在含有100nM IDE1、3μΜCHIR99021和10μΜ LY294002的RPMI-1640培养基中进行诱导培养，诱导时间为24小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述成肝诱导阶段为将完成内胚层诱导后的细胞在含有100nM IDE1、20ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、10μΜ LY294002和100nM LDN-193189的RPMI-1640培养基中诱导培养48小时；接着将其在含有100nM IDE1、20ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、10μΜ LY294002的RPMI-1640培养基中诱导培养24小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述肝细胞的成熟阶段为将完成肝诱导阶段后的细胞在含有150ng/mL肝细胞生长因子(HGF)、20ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、30ng/mL抑瘤素M(OSM)、2×10^-5mol/L地塞米松以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中诱导培养，培养时间120小时。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤a分离得到的hADSCs培养3-7代后再按步骤b所述方法进行诱导培养。

7.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：所述hADSCs在步骤b之前接种于Ⅰ型胶原包被的培养皿中进行后续诱导培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述hADSC接种于Ⅰ型胶原包被的培养皿中，当细胞长满培养皿底部后按步骤b的进行诱导培养。