[发明专利]表达耐热谷胺酰内肽酶的工程菌、制备方法及应用

权利要求书

1.一种表达耐热谷胺酰内肽酶的基因工程菌，其特征在于：由嗜热细菌 Thermoactinomycessp.CDF的基因组为模板经克隆得到的耐热谷胺酰内肽酶TS-GSE的基 因插入载体pET-26b(+)中得到重组表达质粒pET-26b-TS-GSE，转化大肠杆菌BL21(DE3)得 到的基因工程菌，该基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO： M2015771，菌株名称为大肠杆菌BL21(DE3)/pET-26b-TS-GSE，EscherichiacoliBL21 (DE3)/pET-26b-TS-GSE。

2.制备权利要求1中表达耐热谷胺酰内肽酶的基因工程菌的方法，包括引物设计，重组 表达质粒构造和宿主菌株转化，其特征在于：

1)所述的引物设计是根据嗜热细菌Thermoactinomycessp.CDF中的耐热谷胺酰内肽 酶的基因序列和表达载体pET-26b(+)的序列特征，设计含有NdeI酶切位点的上游引物和 含有BamHI酶切位点的下游引物,

上游引物SEQIDNO:1核苷酸序列是：

5’-CGGCATATGAAAGCCGATGCAGTGTTTGCC-3’

下游引物SEQIDNO:2核苷酸序列是：

5’-CGCGGATCCCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGGTCTTTCCAAGTGTTCAG-3’

2)所述的重组表达质粒构造是以耐热谷胺酰内肽酶TS-GSE的基因序列为模板，运用 PCR扩增技术，得到克隆产物，用NdeI酶和BamHI酶双酶切，并将酶切产物连接到载体pET- 26b(+)的双酶切位点上得到重组表达质粒pET-26b-TS-GSE；

3)所述的宿主菌株转化就是将重组表达质粒pET-26b-TS-GSE转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，经卡那霉素筛选并验证后获得表达耐热谷胺酰内肽酶的基因工程菌BL21(DE3)/ pET-26b-TS-GSE，保藏编号为CCTCCNO：M2015771。

3.由权利要求1中所述的基因工程菌制备耐热谷胺酰内肽酶的方法，包括接种、培养、 诱导、破碎、分离和纯化，其特征在于：首先将基因工程菌BL21(DE3)/pET-26b-TS-GSE接种 到含有30-50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于30-40℃培养至菌浓度OD₆₀₀达到0.6-1.0时， 向发酵液中加入浓度为0.4-0.6mmol/LIPTG，25-30℃发酵诱导4-6h，离心分离得到菌体， 向菌体中加入pH7-8的Tirs-HCl缓冲液，超声破碎后离心，上清液即为粗酶液，将粗酶液经 过55-60℃保温处理后，取其上清液即为纯化前的样品，样品经过Ni-NTA亲和层析纯化。

4.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于将基因工程菌接种到含30μg/ml卡那霉素 的LB培养基中，在37℃培养，当菌浓度OD₆₀₀达到0.6左右时，向培养液中加入0.4mmol/L IPTG，并在30℃发酵培养4-6h，发酵液经离心得到菌体，加入pH8.0的Tris-HCl缓冲液，超 声破碎细胞，取上清液于60℃保温30min，离心后的上清液即为纯化前的样品，样品经过Ni- NTA亲和层析纯化。

5.权利要求3中所述耐热谷胺酰内肽酶TS-GSE在高温条件下可以水解常温条件下难以 酶解的蛋白质，用于质谱测序或分析蛋白质的结构。