[发明专利]一种基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物分子育种的基因工程技术领域，具体涉及一种基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法。

背景技术

免疫抗病研究是现代家禽育种研究的一大热点。家禽的品种、养殖环境、饲料等都会在实际生产过程中对禽类的抗病力产生影响，但禽类机体自身固有免疫代谢能力在机体抗病效应中的表现中有着举足轻重的地位，所以，准确认识动物机体免疫器官在不同时间阶段免疫相关基因的表达特性，是免疫抗病研究的基础。

白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)是一种能激活嗜中性粒细胞的趋化性细胞因子(Chemokine，chemotacticcytokine)，是一种具有内源性白细胞趋化性和活化性作用的碱基-肝素结合性蛋白质。趋化性细胞因子是一类由组织细胞和炎性细胞衍生的、具有白细胞趋化活性的肽分子，为一小分子生物活性肽家族。1988年Matsushima等首先报道人IL-8序列，并将其基因定位于4q12-q21，基因全长3211bp，包括4个外显子和3和内含子。1993年Barker等报道了第一份关于鸡IL-8基因的研究，结果表明鸡IL-8基因同人类IL-8基因结果一样，包含4个外显子和3个内含子，其中鸡的第二个内含子要比人的大，而哺乳类IL-8的第二个内含子把一个开放阅读框给隔开。鸡的IL-85′非翻译区的启动子处有保守的NF-l和NF-kB结合位点，缺乏AP-1和CCAT盒，但存在潜在的AP-1结合位点和CCAT盒和其它的转录结合位点如IRF-1和八聚体，同时鸡IL-8基因的启动子处还含有GAAT基序，这是鸡IL-8基因所特有的。IL-8可以趋化嗜中性粒细胞等多种免疫细胞到病变部位，促进这些细胞活化，引起炎症反应，在动物机体的疾病防御中起着重要的作用。在动物和人体胰腺炎中均检测到IL-8的表达上调。张鑫宇等人对鸡马立克氏病病毒(CMDV)类白细胞介素8(yIL-8)基因进行了克隆和表达，并测定它的趋化性。同时人类医学研究也表明，人类多种肿瘤细胞均可高表达IL-8，IL-8在癌症的发生发展中起着十分重要的作用。

发明内容

本发明提供一种基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，采用分子生物学技术和生物信息学分析方法，在对云南地方鸡IL-8基因mRNA表达量的研究中发现IL-8基因与免疫功能相关，通过云南地方鸡IL-8基因mRNA在云南地方鸡的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量，判断云南地方鸡免疫机能的强弱，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡不容易遭受环境变化和被病原微生物感染，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强。

为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案：

一种基于IL-8基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，包括以下具体步骤为：

1)RNA的提取

①选取同一批次出壳的四个品种(武定鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、大围山微型鸡)健康鸡只120只进行隔离饲养，分别于4、8、12周龄屠宰，采集各个鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊组织，将采集的组织进行低温冷冻，将低温冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；加入1mlRNAisoPlus(宝生物公司)。

②将匀浆液转移至离心管中；

③向匀浆裂解液中加入RNAisoPlus体积量1/5的氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；

④室温静置5分钟；

⑤在4℃条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相；

⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；

⑦4℃条件下离心10分钟；

2)RNA沉淀的清洗

弃去上清，加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，在4℃条件下离心5分钟后小心弃去上清；

3)RNA的溶解

打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后将RNA溶液贮存于-80℃；

4)总RNA纯度、浓度及完整性检测

取1μL总RNA溶于99μL无RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA在OD260nm、OD280nm的吸光值，并求出两者的的比值；

5)总RNA电泳检测