[发明专利]一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌的构建及应用

说明书

本发明的公开了一株产L‑苹果酸的酿酒酵母工程菌的构建及应用，属于发酵工程领域。本发明在高产丙酮酸的菌株S.cerevisiae tTAMΔura3Δtrp1中过量游离表达源于Aspergillus flavus ATCC13697的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)和苹果酸转运蛋白(Afmae)基因，构建了苹果酸积累路径，获得菌株W1101。上述菌株用于发酵生产L‑苹果酸，发酵84h，其苹果酸产量为27.3g/L，而原始出发菌株不积累苹果酸，这将高产L‑苹果酸菌株黄曲霉的代谢路径成功应用于酿酒酵母，为高产L‑苹果酸菌株的构建提供了一种新策略。

技术领域

本发明涉及一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌的构建及应用，属于发酵工程领域。

背景技术

苹果酸(Malic acid)又名二羟基丁二酸，是一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为12种有潜力化合物之一。它是TCA生物体循环的重要中间产物，具有特殊愉快的酸味，易被人体吸收利用，因此作为性能优异的食品酸味剂和功能性食品广泛应用于食品行业。同时具有抗氧化、抑制油脂酸败等作用，被用于化妆品、医药、化工行业。

目前，苹果酸的生产方法主要有：生物催化法、两步发酵法和一步发酵法。国内外以生物催化法为主，其中日本是L-苹果酸主要的生产国与出口国。(1)生物催化法以富马酸为底物经富马酸酶转化生成苹果酸。其原料价格高、成品中杂酸高以及生物污染较大；(2)两步发酵法指经两种微生物分两阶段发酵生产苹果酸。其发酵周期长、副产物多、分离纯化成本高以及培养条件复杂，目前正处于实验室研究水平；(3)一步发酵法指经一种微生物发酵获得苹果酸。其发酵条件简单，生产成本低。

一步发酵法常见使用的微生物有霉菌(黄曲霉、米曲霉)和大肠杆菌工程菌。霉菌发酵生产苹果酸虽然其产量高、生产强度大，但由于其积累大量杂酸，提取成本高、菌丝易结球发酵条件难以控制，同时积累大量毒素，难以进行工业化生产。而大肠杆菌由于最适生长pH为中性，提取时需要添加大量中和剂，成本高、环境污染严重。而酿酒酵母具有耐酸性，故选择其作为宿主菌进行进一步研究。

目前，苹果酸积累的路径主要有四条：1)胞质还原路径，丙酮酸经丙酮酸羧化酶羧化成草酰乙酸，再经过苹果酸脱氢酶的作用生成苹果酸；2)TCA循环；3)乙醛酸循环；4)乙醛酸非循环路径，丙酮酸经乙醛酸循环至苹果酸，但苹果酸不再生成草酰乙酸。由于酿酒酵母不存在将线粒体中的苹果酸转运出细胞质的转运蛋白，且胞质还原路径的理论摩尔得率最高，故只能利用胞质还原路径进行积累。

然而，目前利用酿酒酵母积累苹果酸仍存在几个关键问题：1)发酵周期长；2)生产强度低；3)菌体浓度低，菌株生长缓慢；4)异源表达霉菌等真核生物基因时，内含子去除困难；5)过量表达大片段基因，代谢负担重等。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株利用黄曲霉代谢路径产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌株及其构建方法与应用。本发明是在酿酒酵母中过量表达源于Aspergillusflavus的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)和苹果酸转运蛋白(Afmae)基因构建苹果酸积累路径。

本发明的第一个目的是提供一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌过表达来源于Aspergillus flavus的丙酮酸羧化酶基因Afpyc、苹果酸脱氢酶基因Afmdh和苹果酸转运蛋白基因Afmae。

在本发明的一种实施方式中，所述Aspergillus flavus是Aspergillus flavusATCC 13697。