[发明专利]一种基于CATH-1基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物分子育种的基因工程技术领域，具体涉及一种基于CATH-1基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法。

背景技术

免疫抗病研究是现代家禽育种研究的一大热点。家禽的品种、养殖环境、饲料等都会在实际生产过程中对禽类的抗病力产生影响，但禽类机体自身固有免疫代谢能力在机体抗病效应中的表现中有着举足轻重的地位。所以，准确认识动物机体免疫器官在不同时间阶段免疫相关基因的表达特性，是免疫抗病研究的基础。

Cathelicidins家族抗菌肽是一类具有广谱抗微生物活性的小分子阳离子多肽，是动物体内免疫系统的重要组成部分，作为一种非特异性免疫分子，从动物免疫系统中分离出来的cathelicidins抗菌肽在抵御外来病原体侵染过程中起着重要作用。目前为止，已经从原鸡(Gallus)中发现了四种鸟类cathelicidin家族的多肽，即cathelicidin-1/fowlicidin-1、从鸡脊髓中得到的抗菌肽27(CMAP27)/fowlicidin-2、fowlicidin-3和cathelicidin-B1，并分别命名为CATH-1、CATH-2、CATH-3和CATH-B1。

Cathelicidins除了具有广谱的抗菌活性外，还具有调节适应性免疫、趋化免疫细胞、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡等活性。因此，CATH-1基因的研究对调控畜禽抗病能力具有重要的意义。

发明内容

本发明提供一种基于CATH-1基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，采用分子生物学技术和生物信息学分析方法，在对云南地方鸡CATH-1基因mRNA相对表达量的研究中发现CATH-1基因与免疫功能相关，通过云南地方鸡CATH-1基因mRNA在云南地方鸡的脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中的相对表达量，判断云南地方鸡免疫机能的强弱，在脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中的相对表达量高的云南地方鸡更容易遭受环境变化、病原微生物感染，在脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中的相对表达量低的云南地方鸡免疫机能较强。

为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案：

一种基于CATH-1基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特征在于：所述的基于CATH-1基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法包括以下具体步骤为：

1)RNA的提取

①选取同一批次出壳的健康鸡只100只进行隔离饲养，提取各个鸡只中的RNA，将超低温冻结的RNA提取样品称量后转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；

②将匀浆液转移至离心管中；

③向匀浆裂解液中加入氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；

④室温静置5分钟；

⑤在4℃条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色含RNA的上清液、中间为DNA的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；

⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；

⑦12000rpm4℃离心10分钟；

2)RNA沉淀的清洗

弃去上清液，加入与RNAisoPlus等量的75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，7500rpm4℃离心5分钟后小心弃去上清；

3)RNA的溶解

打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后将RNA溶液贮存于-80℃；

4)总RNA纯度、浓度及完整性检测

取1μL总RNA溶于99μL无RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA在OD260nm、OD280nm的吸光值，并求出两者的的比值；

5)总RNA电泳检测

取3μL总RNA样品经1％琼脂糖凝胶电泳20min后，在凝胶紫外线投射仪下观察电泳结果；

6)PCR引物设计

根据GenBanK中原鸡(Gallusgallus)的相关基因序列，使用引物设计软件primer5.0设计引物，并合成，合成后用荧光定量PCR；

7)检测CATH-1基因的相对表达量

检测云南地方鸡脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中CATH-1基因的相对表达量。

进一步，在步骤1)总RNA的提取①中加入1mlRNAisoPlus。

进一步，在步骤1)总RNA的提取③中加入氯仿的体积量为RNAisoPlus体积量的1/5。