[发明专利]小鼠抗人CK8单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及以原核表达的CK8蛋白免疫小鼠获得的分泌CK8单克隆抗体的杂交瘤 细胞株8G8，属于生物工程技术领域。

背景技术

CK即细胞角蛋白（Cytokeratin），是细胞骨架蛋白之一——中间丝的多基因家族 中的一员，为上皮细胞主要的结构蛋白和分化的早期标志物。细胞角蛋白由30种不同的基 因编码，这些基因可以转录成分子量不同的20种多肽，分别命名为CK1~CK20。细胞角蛋白 又可根据等电点的不同分为酸性（Ⅰ类）蛋白，包括CK9~CK20，其基因被定位在染色体17q；及 碱性（Ⅱ类）蛋白，包括CK1~CK8，其基因被定位在染色体12q。一般而言，相对分子质量小的 细胞角蛋白总是与相对分子质量大的细胞角蛋白配对，而酸性细胞角蛋白总是与碱性细胞 角蛋白配对。每种细胞角蛋白的表达与其所在组织器官的分化有密切的关系，细胞角蛋白 的基因表达有很高的规律性，每种上皮组织至少表达一种Ⅰ型及一种Ⅱ型细胞角蛋白，细 胞分化的不同阶段及不同类型上皮细胞表达不同的细胞角蛋白。CK8属于碱性（Ⅱ类）细胞 角蛋白，分子量为52kDa。CK8定位于细胞质中，由483个氨基酸组成，分为3个功能结构域，即 头部结构域（N端）、杆状结构域和尾部结构域（C端）。杆状结构域的起始端和末端氨基酸序 列高度保守，这部分区域的点突变会导致异常的中间丝结构和动力学，引起细胞完整性的 丧失并导致严重的病征。头和尾端包含多个生理上必需的翻译后修饰位点，这些位点与中 间丝蛋白的结构性质有关。正常情况下，CK8与相应的酸性细胞角蛋白以1:1的比例形成异 二聚体，主要表达于单层上皮细胞。CK8和CK18形成的异聚物中间丝具有独特的黏弹性，在 细胞变形和其它机械应激时，会表现出比微管和肌动蛋白微丝更强的抵抗能力，维持细胞 的机械完整性。作为细胞骨架的重要组成成分，除参与维持细胞的机械完整性外，CK8~CK18 还可以调节蛋白激酶C介导的肝上皮细胞的黏附与迁移以及与网格蛋白共同调节细胞粘 附、细胞大小、蛋白质合成和细胞G1/S期的转变。CK8主要表达于所有的单层上皮组织中，存 在于某些正常上皮和肿瘤上皮，包括许多导管上皮和腺上皮：如结肠、胃、小肠、气管的上皮 和移行上皮，鳞状上皮一般不表达CK8。因此CK8可作为腺上皮及其来源的肿瘤的首选标记 物。研究表明，CK8表达或翻译后修饰异常将影响其活性，是相关肿瘤发生发展的重要原因 之一。对CK8在肿瘤发生发展中作用的深入研究，可以为肿瘤的预防及治疗提供帮助。目前， 国内外已经获得了多种CK8的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀 释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的CK8的单克隆抗体对于临床诊断 和科学研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测CK8表达 的小鼠抗人CK8单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

（1）根据CK8的基因序列（NM_001256282.1）的编码框，设计1对特异引物，Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增CK8基 因，构建重组表达载体PET28a-CK8，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和 纯化蛋白作为抗原。

（2）采用经典的细胞融合技术制备CK8单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS- PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。

（3）采用免疫印迹法（Westernblot）检测CK8单抗的效价及特异性，通过免疫组织 化学分析CK8单克隆抗体染色人乳腺癌和结肠腺癌石蜡切片。

（4）根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体CK8重链可 变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳 性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体CK8的重链和轻链可变区序列。

本发明提供的以原核表达的CK8蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌CK8单克隆抗体 的杂交瘤细胞株，名称为8G8，分类命名为小鼠抗人CK8杂交瘤细胞系，该细胞株8G8已于 2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCCNo.6920。