[发明专利]双抗性CRISPR/Cas9载体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种新型的双抗性 CRISPR/Cas9载体及应用。

背景技术

水稻作为农作物基因功能研究的模式植物，与其相关的遗传学和 分子生物学研究一直受到研究者们的重视。通过转基因获得目标基因 改良的水稻成为研究水稻基因功能的主要手段。虽然水稻的转基因技 术在目前已经成熟，但是通过转基因获得的水稻材料由于无法去除转 入的外源T-DNA，经常会对实验结果造成不良影响，也增加了实验结 果的不确定性和实验过程的复杂性。

目前对于基因的编辑技术飞速发展。近两年来，由CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术成为生物界获得基因敲除突变体的主流技 术。该系统来源于细菌的免疫系统，其工作原理是crRNA (CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。而通过人工设 计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguide RNA)，引导Cas9对DNA定点切割。通过人工合成与靶基因序列 同源的sgRNA，可以直接实现对目标基因的编辑，并且这种基因的被 编辑状态可以稳定遗传到下一代，无需CRISPR/Cas9外源T-DNA的持 续存在。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的双抗性CRISPR/Cas9载体及应 用。

本发明的另一目的是提供不含有外源T-DNA序列的水稻CRY1a 基因纯合突变体植株的构建方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种双抗性CRISPR/Cas9载体， 其是通过PCR扩增35S启动子和NOS终止子序列，利用重叠PCR将35S 启动子和NOS终止子序列与体外合成的3×flag序列串联起来，将串联 序列插入到载体pFGC5941的EcoRI和HindIII位点之间，得到载体I； 通过PCR扩增gypsy绝缘子序列，将扩增得到的序列插入到载体I的 EcoRI和HindIII位点之间，得到载体II；通过PCR扩增NLS-cas9-NLS 序列，将扩增得到的序列插入到载体II的SpeI位点，得到载体III；最 后通过PCR扩增35S:HPT序列，将扩增得到的序列插入到载体III的 XbaI位点，即构建获得双抗性CRISPR/Cas9载体。

其中，3×flag序列如SEQIDNO:1所示，gypsy绝缘子序列如SEQ IDNO:2所示，NLS-cas9-NLS序列如SEQIDNO:3所示，35S:HPT序列 如SEQIDNO:4所示。

扩增35S启动子和NOS终止子序列的引物分别如SEQIDNO:5-6 和SEQIDNO:7-8所示；扩增gypsy绝缘子序列的引物如SEQID NO:9-10所示；扩增NLS-cas9-NLS序列的引物如SEQIDNO:11-12所 示；扩增35S:HPT序列的引物如SEQIDNO:13-14所示。

本发明双抗性CRISPR/Cas9载体的全序列如SEQIDNO:15所示。 该载体可引导外源序列在宿主中编辑目的靶基因的序列。

本发明还提供含有所述双抗性CRISPR/Cas9载体的工程菌及转 基因细胞系。

本发明还提供所述双抗性CRISPR/Cas9载体在获得不含有外源 T-DNA序列的转基因植株中的应用。例如，通过第三方软件对靶基因 的目标区域进行预测，然后将预测序列和U3启动子一同插入到双抗 载体中对靶基因进行编辑。

具体地，所述应用是针对植物中的目标基因设计基于 CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段 克隆到双抗性CRISPR/Cas9载体中，转化植物，用潮霉素B筛选阳性 转基因植株，再用Basta筛选不含有外源T-DNA序列的阳性转基因植 株。