[发明专利]一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组及其应用。

背景技术

猪圆环病毒Ⅱ型(PorcinecircovirusⅡ,PCV2)、猪细小病毒(porcineparvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(Porcinepseudorabiesvirus,PRV)是我国集约化养猪场普遍流行的重要病原，给养猪业造成了严重的经济损失。由于这三种病毒常呈混合感染，增加了分析判断群体感染和发病的难度。目前，常规的分析方法如病毒分离、血清学方法等存在着耗时长、敏感度低的缺陷，已不能满足现实生产及防病需要。

目前，由猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒以及猪伪狂犬病病毒感染引起猪免疫抑制及繁殖障碍等病症已经成为影响我国乃至全球养猪业的一种疾病，造成巨大经济损失。我国是养猪大国，研究针对三种病原混合感染的快速准确的分析方法对于养猪业健康发展具有重要意义。传统的病毒分离鉴定等方法耗时耗力，对于实验条件要求比较苛刻，在一般实验室及基层单位较难进行，同时受采样条件所限，分离率往往也较低，并且传统的血清型诊断方法有操作繁琐复杂，耗时耗力，特异性和灵敏性低等多种不足。随着分子生物学的发展，PCR检测方法能够快速、高效的检测出病原体。。

聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)具有快速、敏感、特异等优点，自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势，多重PCR方法不仅保持了普通PCR敏感性高和特异性强的优点，且具有一次检测多种病原的优势，更适于混合感染的快速诊断。本发明针对三种病毒的保守基因设计了特异性引物，拟构建能够同时检测猪三种常见病毒感染的多重PCR方法并初步应用于临床样品的检测。

多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。所以建立检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒的三重PCR方法对于猪关节病的防治具有重要意义，可以为其防治提供有力的技术手段。

发明内容

鉴于三种病毒是当前集约化猪场的常见重要病原体，且往往与多种病毒和细菌混合感染，引起猪免疫抑制及繁殖障碍等疾病，传统的分析鉴定技术费时费力，不适于临床快速检验分析，也不适于大规模的流行病学调查的现状，本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组及其应用。

本发明针对实际生产中猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒混合感染，且临床很难区分的情况，本着从样品中同时分析鉴定三种病原体的目标，从已发表的文献中筛选出具有病原体致病性特点的保护性片段的编码基因片段，作为PCR检测的三个基因靶点，得到同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重PCR的引物组。同时本发明将扩增这3个基因片段的引物组放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异性等各项参数调整优化，建立了可直接从样品中鉴定分析三种病原体的三重PCR方法。

猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2编码病毒的Cap蛋白，血清学实验显示，对于无致病性的PCV1与致病性的PCV2，两者的Rep蛋白会产生抗原交叉性，而Cap蛋白不产生交叉反应，因此选择ORF2编码的结构蛋白作为检测目的片段；猪伪狂犬病毒(PRV)的gB(gⅡ)是PRV所有糖蛋白中最保守的，是病毒的一个重要包膜组分和中和抗原，是病毒感染宿主细胞必不可少的成份；而猪细小病毒(PPV)的VP2蛋白是构成PPV病毒粒子的主要保护性抗原，具有血凝活性和良好的免疫原性，可以诱导机体产生强烈的免疫反应。因此，与传统PCR不同，本发明选择上述三个基因片段作为三重PCR的靶标分子，这样一方面可及时验证目标病原体在样品中的存在，更重要的是可对所扩增的病毒保护性片段进行序列分析，实时监测病原主要保护性蛋白的变异，为及时掌握病毒致病性特点及其变异趋势和规律、选择合适的疫苗提供科学依据。

本发明是通过以下的技术方案实现的。