[发明专利]采用LRS获取白细胞的方法及所获得白细胞在基础实验中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种外周血白细胞的获得方法和所获得白细胞的应用，尤其涉 及一种外周血单个核细胞的获得方法和所获得的外周血单个核细胞在基础实验 中的应用。

背景技术

人外周血白细胞是基础实验常需的资源，尤其在免疫学、药理学、肿瘤学 研究以及血液学实验研究中，健康人白细胞包括T淋巴细胞，B淋巴细胞，NK 和单核细胞的需求特别大，特别是一系列基础实验如T细胞功能调节、Th细胞 分化、移植排斥的混合淋巴反应等实验均需要健康人外周血白细胞；此外在一 些实验动物构建和肿瘤免疫治疗中需要的白细胞特别是T细胞数量也特别巨大。 原本这些实验均需要中心血站或者志愿者反复无偿献血提供全血，然而近年来 临床血液供应都存在困难的情况下，通过原来的实验用血来源途径满足基础实 验需求已经不现实，因此寻找一个新的方法代替传统的途径是当下之急。

最近，有研究者从全血白细胞滤器获得了大量的白细胞，并且证实这些白 细胞在活力和功能方面都能应用于基础实验研究。如Meyer等发现从全血白细 胞滤器获得大量外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)， 并且经过一系列体外实验证实：所获PBMC很好的包含了各种细胞种类，并且 各类细胞亚群的比例与正常人外周血相当，这些细胞可作为实验细胞的一个新 的来源。而Ivanovic等证实从滤器中还可获得大量CD34+细胞，并发现这些细 胞与来源于外周血的CD34+细胞在功能方面不存在显著性差异。再如Ebner等 人发现，滤器中所获得的CD14+前体细胞可在体外条件下诱导分化为用于免疫 治疗的树突状细胞。但是从全血白细胞滤器中获取PBMC存在一个问题，即全 血采集数小时至十数小时后才进行白细胞过滤，这时再处理滤器，白细胞的获 取量将减少。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种采用LRS获取白细胞的方 法及所获得白细胞在基础实验中的应用，该获得白细胞的方法实验设备要求低、 操作简单省时、白细胞的收集率高、纯度高，且所获得白细胞可直接替代人外 周血所获得的白细胞，为白细胞的资源回收利用提供了一条简便高效的途径。

本发明的技术方案是：

一种采用LRS获取白细胞的方法，该方式是对经血小板单采术后的单采血 小板白细胞滤器在百级洁净区内进行包括如下步骤所述的操作：

(1)使用D-Hank’s液冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置3～4 次，去除白细胞过滤装置上附着的血渍并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一 起；

(2)继续使用D-Hank’s液冲洗经(1)处理后的单采血小板白细胞滤器上 的白细胞过滤装置2～3次，每次30～35s，去除白细胞过滤装置上粘附的物质并 将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；

(3)再次使用D-Hank’s液冲洗经(2)处理后的单采血小板白细胞滤器上 的白细胞过滤装置2～3次，将粘附其上的白细胞冲洗脱落，并将每次冲洗后所 得的冲洗液收集在一起；

(4)将(1)、(2)和(3)中收集到的冲洗后所得的冲洗液混合形成混合 液并转移至无菌离心管中，采用D-Hank’s液将上述混合液进行稀释，其中混合 液与D-Hank’s液的质量比为1:18～20；然后采用Ficoll密度梯度离心法按照1:2 进行梯度分离，其中离心速率为1800～1900rpm，离心温度为37～37.5℃，离心 时间为30～35min，离心过程结束后得到离心液体；

(5)用吸管吸取(4)中得到的离心液体的中间白膜层，得到白细胞粗品， 然后采用PBS缓冲液对该白细胞粗品进行洗涤，并采用常温下1200～1300rpm的 转速离心5～6min后，弃去上清液，得到沉淀物；将该沉淀物再次使用PBS缓冲 液进行洗涤离心后，得到的最终沉淀物为存活的白细胞。

其进一步的技术方案是：