[发明专利]转基因植物中cry1Ie基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因植物中cry1Ie基因的引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

2014年全球转基因作物种植面积高达1.815亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性状为抗虫和抗除草剂。来源于苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）的抗虫基因是目前在转基因植物中应用最广的抗虫基因，包括cry1Ab、cry1F、cry1Ie、cry1C、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等，其中cry1Ie基因是我国自主研发的一种高效抗虫基因，已广泛应用到转基因玉米、大豆的新品种研究中。针对cry1Ie基因开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。

转基因成分检测技术主要分为两大类：一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，目前PCR技术应用最为广泛，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长（约3~4h），难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。

LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件（60~65℃）进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1h内完成；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：可通过肉眼或浊度仪观察反应管内的沉淀变化，或在反应管中加入染色剂后通过肉眼观察颜色变化等方法，对扩增产物进行便捷的检测。

LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因植物中cry1Ie基因的检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明的一个目的在于公开一种转基因植物中cry1Ie基因的LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于公开一种转基因植物中cry1Ie基因的LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因植物中cry1Ie基因的LAMP检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

根据cry1Ie基因的核苷酸序列，设计cry1Ie基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQIDNO:1~5；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性进行验证。

转基因植物中cry1Ie基因的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LF，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物F3：CCTGCGCATGAGCGAG（SEQIDNO：1）；

外引物B3：GGTCGATCAGCTCCTCCA（SEQIDNO：2）；

内引物FIP：AGGATCTTGCCGGCGATGCCACGAGAGCATCGACCCCT（SEQIDNO：3）；

内引物BIP：GCCTGTACAGCTTCATCCTGGGCGTGCTCCATGAAGATCTCC（SEQIDNO：4）；

环引物LF：CCGGTCTGGATGGTGCT（SEQIDNO：5）。

转基因植物中cry1Ie基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

（1）检测引物溶液：由上述5条引物配制的检测引物溶液，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP和环引物LF的浓度依次为4~6μmol/L、4~6μmol/L、32~48μmol/L、32~48μmol/L和4~6μmol/L；

（2）具有链置换活性的BstDNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；