[发明专利]一种高纯度胰激肽原酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种高纯度胰激肽原酶的制备方法，属于胰激肽原酶提取制备技术领域。

背景技术

胰激肽原酶，又称血管舒缓素或胰激肽释放酶，是一类内切型蛋白水解酶，它是从猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。

胰激肽原酶在药理和临床上的功用主要为：作为扩张血管改善微循环作用的周围血管扩张药、激活纤溶酶、抑制磷脂酶A2、具有降低血粘度，以及防止血小板聚集、防止血栓形成等作用。其主要用于微循环障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病、周围神经病、视网膜病、眼底病及缺血性脑血管病的治疗，也可用于高血压病的辅助治疗。

现有胰激肽原酶的纯化方法一种是使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离；或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡聚糖上，并分离之，但是该方法离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备；另外一种纯化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之，但是该方法不能够使产品在洗脱过程中除去不需要的杂质。

另外，国家卫生部批转作为生化药品执行部颁药品最初标准规定：胰激肽原酶系猪胰中提取的蛋白酶，干品效价每1mg不得少于50单位，比活不得少于300单位/mg蛋白。直至2006年国家药典委员会对该标准进行了修订，增加了纯度指标，规定供口服用胰激肽原酶的纯度不得低于65％。这一指标的制定从一定程度上提高了对胰激肽原酶的品质要求，但是目前国内生产胰激肽原酶工艺水平不高，产品纯度所能达到的程度不均衡，质量稳定性差，因此在制定纯度限度要求时，对纯度要求只有65％。最新发布的中国药典2010版中将胰激肽原酶作为新品种收录其中，对纯度要求做了修订，胰激肽原酶的纯度要求也仅提高到70％。

发明内容

本发明主要解决的技术问题：针对目前传统方法在纯化胰激肽原酶的过程中，虽然能够使得胰激肽原酶得到纯化，但是还是存在工艺水平不高，产品纯度所能够达到的程度不均衡，质量稳定性差，导致无法达到国家指标的现状，提供了一种利用茶籽提取液和腐殖质污泥混合、经过滤得过滤液，放入茶籽麸中蒸煮、挤压制成茶籽麸饼，随后收集猪胰腺和口水，待混合后程序升温，并依次与茶籽麸饼进行混合，混合过程中逐渐加量，并使用不同浓度的去离子水和氯化钠分别进行三次淋洗，随后收集淋洗液，通过氢氧化钠调节pH值后，加入乙醇过滤，最终将得到的滤液进行抽滤，干燥，从而得到高纯度胰激肽原酶的制备方法。本发明操作简单，工艺水平高，不仅使得比活达到了850单位/mg蛋白以上，而且纯度达到了92％以上，达到了国家指标，适合大规模应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

（1）取7～10cm厚的农村河道淤泥7～8kg，放置在干燥机中，在65～70℃下干燥处理，当河道淤泥中含水量为10～15％时，停止干燥，取出放入容器中，置于阴凉处自行冷却至室温，并使其上下分层，之后用刮刀轻轻刮去上层4～8cm后的河道淤泥，得下层河道腐殖质污泥；

（2）取500～600g干燥无霉菌的茶籽，放入清水中反复清洗，去除表面残留污物后，平铺在铺有纱布的钢筛中，置于干燥机中，在温度为100～105℃下干燥处理15～25min，使得茶籽含水量为3～5％，再将干燥后的茶籽放入烧杯中，加入800～1000mL质量浓度为75％的乙醇溶液，混合均匀，置于超声振荡仪中，设置超声振荡频率为20～25KHz，超声功率为100～150W，超声振荡反应1～3h，过滤，得滤液；

（3）将上述得到的滤液放入索式抽提器中，抽提50～55min，得滤液抽提液，再将得打的滤液抽提液放入蒸馏装置中，在55～65℃下水浴加热35～40min，去除乙醇，得到茶油提取物；

（4）将上述得茶油提取物放入容器中，向其中加入上述步骤（1）得到的河道腐殖质污泥，以500～600r/min的转速搅拌20～30min，使其完全混合均匀，得混合物，随后将得到是混合物放入高速离心机中，在1200～1500r/min的转速下离心处理40～45min，去渣，得上清液；