[发明专利]以基因组岛为基础的整合载体pLMO033及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种以基因组岛为基础的整合载体pLMO033及其制备方法和应用；所述整合载体pLMO033携带有int/att元件；所述制备方法包括构建中间过渡型质粒pLMO032的步骤和改造所得中间过渡型质粒pLMO032获得整合载体pLMO033的步骤；所述应用具体指在超嗜热古菌中进行基因单拷贝回补或外源基因表达的应用。本发明提供的整合载体能够在大肠杆菌内复制，在超嗜热古菌P.yayanosii A1菌株中高效的进行位点特异性整合并能稳定遗传，该载体可作为超嗜热古菌的基因回补载体应用于基因功能鉴定研究。

技术领域

本发明涉及一种整合型载体的制备方法和应用，具体是涉及一种以基因组岛为基础的整合载体pLMO033及其制备方法和应用。

背景技术

Thermococcales是一类广泛分布在地热环境，如热泉、火山和深海热液口的超嗜热古菌，位于16S rRNA基因系统进化树的根部，被认为是研究地球早期生命现象和生物进化的良好材料。由于受其高温、厌氧生长特性的影响，开发相应的遗传工具用于分子遗传学的研究一直比较滞后。现有的遗传操作工具主要表现为基因敲除工具及自主复制型穿梭载体，这些在Thermococcales中的一些成员如Thermococcus kodakarensis,Thermococcusbarophilus,Pyrococcus abysii,Pyrococcus furiosus和Pyrococcus yayanosii中已有相关报道，但是仍然缺乏位点特异性的整合型载体。P.yayanosii CH1是第一株分离自深海热液口的超嗜热嗜压厌氧古菌。针对其兼性嗜压突变株P.yayanosii A1已经开发出基因敲除系统用于其遗传研究，但是尚缺乏有效的位点特异性单拷贝整合载体用于基因回补或基因表达。因此，开发出有效的位点特异性整合载体十分必要。

基因组岛被认为是一种整合接合元件(ICEs)，在许多微生物基因组中都有发现，通过水平基因转移的方式从外界获得额外基因是基因组岛形成的重要形式。基因组岛通常位于tRNA的3’末端，两端具有相同或相近的DR序列。在细菌中，一些基因组岛可以自发的从核心染色体上发生整合或删除，而DR序列可能是基因组岛整合或删除的热点区域。而在超嗜热古菌中，尚没有关于基因组岛移动性及利用基因组岛开发遗传工具的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种可应用超嗜热古菌的、具有高效位点特异性整合能力的载体pLMO033；本发明还提供了制备上述整合载体pLMO033的方法和其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种整合载体pLMO033，所述整合载体包含来自于可移动型基因组岛int/att元件。

优选地，所述可移动型基因组岛int/att元件来自于超嗜热古菌P.yayanosii A1的可移动型基因组岛PYG1。

进一步优选地，所述整合载体的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供一种整合载体pLMO033的制备方法，包括如下步骤：

克隆基因组岛中int/att元件，将所述元件插入到自杀载体pLMO03中，得中间过渡型质粒pLMO032；

移除所述中间过渡型质粒pLMO032的非必需基因，得改造的线性化质粒；

构建多克隆位点，并其插入所述线性化质粒中切除非必需基因的区域，即得整合载体pLMO033。

优选地，所述int/att元件的序列长度为1263bp，碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述插入具体采用T4 DNA连接酶。

优选地，所述多克隆位点为以下组合中的一种或多种：Pst Ⅰ、Not Ⅰ、Xho Ⅰ、SciI、Bss H Ⅱ、Bpu 10 Ⅰ、Pme Ⅰ。