[发明专利]一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法

权利要求书

1.一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法包括：

步骤一、将新鲜人类脐带里的沃顿胶组织制作成梯度沃顿胶组织块，再经过消化冻融并冻干制作成一体化梯度脱细胞软骨支架材料；

步骤二、将检测合格的转化生长因子-β1缓释微球负载在支架材料上，与第3代脐带间充质干细胞进行复合诱导培养成组织工程梯度软骨复合体。

2.如权利要求1所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，步骤一所述的制作分梯度的沃顿胶组织块的具体方法为：

将经过预冻的脐带标本垂直其长轴切成高20mm的圆柱体，剥离脐带外膜后完整切除中心脐血管区域，剩下呈环柱体形状的沃顿胶组织块，将环柱体沃顿胶组织块沿环柱体高度线切开，将沃顿胶拉伸展开成一大块长方体，最后选取较平整无缺损的部位将沃顿胶加工成12mm×8mm×3mm大小长方体的组织块。

3.如权利要求1所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，步骤一所述的制作一体化梯度脱细胞软骨支架材料的具体方法为：

步骤一、将沃顿胶组织块置入含抗生素PBS液中浸泡冲洗5min，重复3次；

步骤二、双蒸水浸泡沃顿胶组织块1min；

步骤三、胰蛋白酶消化组织块15min；

步骤四、双蒸水震荡漂洗组织块5min；

步骤五、将漂洗干净的组织块装入冻存管里，快速置入含液氮罐的液氮中冷冻15min，取出后将沃顿胶组织块立即经37℃水浴快速复温，重复上述急冻急复温过程3次；

步骤六、再次将组织块置入含抗生素PBS液中，浸泡冲洗10min次；

步骤七、双蒸水浸泡组织块5小时，每15min震荡1次；

步骤八、将组织块置入－80℃的低温冰箱预冻1h从而调节孔径大小；

步骤九、真空冷冻干燥机中将组织块真空冷冻干燥12h得到沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料；

步骤十、将得到的沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料使用环氧乙烷灭菌8h后放入冰箱密封保存备用。

4.如权利要求1所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，步骤二所述的组织工程梯度软骨复合体的制作方法包括：

步骤一、负载生长因子缓释微球到支架材料：

取制备好的包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球粉末100mg，在20ml含抗生素的无菌双蒸水中分散，充分分散后制成缓释微球悬浊液；将制备好的沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料放入12孔无菌培养板里，往每个孔里缓慢滴加缓释微球悬浊液，直到使支架材料里充分吸满缓释微球悬浊液并完全浸泡在缓释微球悬浊液中，最后将支架材料进行真空低温冷冻干燥12h后环氧乙烷灭菌8h备用；

步骤二、负载DMEM到支架材料：

将经过环氧已烷灭菌的支架用无菌磷酸盐缓冲液浸泡20分钟，甩掉多余水分后将支架材料置于12孔培养板内，用含15％PBS的含抗生素DMEM培养基预湿8小时，干燥备用；

步骤三、细胞-支架复合物的构建。