[发明专利]新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供的新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT‑PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组，引物组有引物F和R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1和2的碱基序列。探针组有探针V‑T和L‑T,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.3和4的碱基序列。强毒探针V‑T的5＇端标记有报告荧光染料FAM，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ1；弱毒探针L‑T的5＇端标记有报告荧光染料JOE，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ2。对新城疫病毒的防控具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点。

技术领域

发明涉及一种检测新城疫病毒强、弱毒的一步双重荧光RT-PCR试剂盒的研制，属于一种快速、灵敏的针对农产品的安全检测技术，为禽类养殖和禽产品的“绿色产业”提供技术保障；主要应用于农牧企业和监管机构，具体涉及新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)是一种由新城疫病毒(Newcastle diseasevirus,NDV)引起的禽类烈性、高度接触性、致死性传染病，以侵害鸡和火鸡为主，同时也感染其他家禽和野禽，ND具有传播迅速、发病率高、病死率高的特征，同时也是困扰我国养禽业的重要疫病之一。近年来，随着ND弱毒疫苗的广泛应用，新城疫的发病情况和流行态势日趋复杂，普通的血清学诊断方法(HI试验)不能区分弱毒疫苗诱导的抗体与现场速发型强毒感染的反应，而毒力测定通常包括鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)等致病性试验，这些试验不仅需要实验动物，而且耗时费力，不能满足生产、防疫的需要,在实际应用中有一定的局限性。

在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。建立多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪器具有相应的多个检测通道。目前市场上还未出现检测新城疫病毒强、弱毒一步双重荧光RT-PCR的试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏性好、特异性高、准确可靠、快速方便的新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒，同时检出新城疫病毒强、弱毒株，为新城疫的监测提供技术支撑。

为解决上述问题，本发明采取以下技术方案：新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒包括引物组和探针组，引物组有引物F和R，它们分别如序列表SEQ.ID.NO.1和2的碱基序列。探针组有探针V-T和L-T,它们分别如序列表SEQ.ID.NO.3和4的碱基序列。

强毒探针V-T的5＇端标记有报告荧光染料FAM，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ1；弱毒探针L-T的5＇端标记有报告荧光染料JOE，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ2。

引物F和R、探针V-T、探针L-T的摩尔质量比为2:2:3:1

该试剂盒含有以下试剂

A液：PCR扩增缓冲液、通用引物F和R、探针V-T和L-T；

B液：NA-1+LaSota模板，作为阳性对照；

C液：ddH₂O作为阴性对照。

PCR反应体系中通用引物F、R终浓度为0.4μM/L,强毒探针终浓度为0.6μM/ml,弱毒探针终浓为0.2μM/L。

针对目前缺乏对新城疫病毒强、弱毒株的检测和诊断的有效可靠的技术，发明人通过对引物和探针不同浓度的配比，获取最佳引物和探针浓度的组合。据此建立了新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR的检测方法，并制定了检测试剂盒。实验证明，本发明具有以下优点：