[发明专利]产肌苷的重组菌及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种产肌苷的重组菌，所述重组菌相比于出发菌具有弱化的磷酸戊糖变位酶活性或失活的磷酸变位酶，所述出发菌是能够累积肌苷的菌株。发现了新的提高肌苷的发酵产量的改造靶点并构建了相应的重组菌，并证明了可显著提高重组菌的肌苷产量并降低副产物次黄嘌呤的积累量。

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及产肌苷的重组菌及其制备方法与应用。

背景技术

肌苷，即次黄嘌呤核糖核苷，由核糖与次黄嘌呤通过β糖苷键连接而成。肌苷的用途非常广泛，在食品行业中，肌苷是增鲜剂肌苷酸二钠合成的前体；在医药行业中，肌苷及其衍生物是多种抗病毒药物，如利巴韦林、无环鸟苷等合成的中间体，受到医药界的极大重视。此外，肌苷还被用于农业、化工和营养保健等行业。

肌苷的生产方法主要有核糖核酸(RNA)水解法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法由于生产成本低、能耗低、生产周期短、控制容易且产量大等优点，已成为目前工业生产肌苷的主要方法。微生物发酵法最常采用物理或化学诱变获得的枯草芽胞杆菌、产氨短杆菌和短小芽胞杆菌等的突变株发酵生产肌苷。该方法获得的菌株会积累大量的负效应突变，导致菌株生长缓慢、环境耐受性降低以及营养需求增高等问题。这些缺陷限制了菌株的工业化应用，因此亟需通过代谢工程改造的方法构建遗传背景清楚的肌苷高产菌株。

迄今为止，从遗传背景清楚的菌株出发从头构建肌苷生产菌的报道有三篇。2007年，研究者在已经失活了purA、deoD、purF、purR、add、edd、pgi和xapA等多个基因的大肠杆菌W3110中过表达脱敏的prs和purF基因，经72h发酵得到了7.5g/L的肌苷(Shimaoka,M.,etal.2007Effect of amplification of desensitized purF and prs on inosineaccumulation in Escherichia coli.Journal of Bioscience and Bioengineering103(3):255-261.)。2010年，Asahara等以枯草芽胞杆菌168为研究对象对肌苷生产菌的构建进行了研究。首先将编码腺苷酸琥珀酸合成酶purA和肌苷酸脱氢酶guaB的两个基因失活，然后将两个编码嘌呤核苷磷酸化酶的基因punA和deoD失活。为加强嘌呤核苷的合成，破坏了嘌呤操纵子阻遏蛋白purR和5’-UTR(5’-非翻译区)。最后对嘌呤操纵子的启动子进行了优化，发酵72h，肌苷产量达到6g/L(Asahara,T.,et al.2010.Accumulation of gene-targeted Bacillus subtilis mutations that enhance fermentative inosineproduction.Applied Microbiology and Biotechnology 87(6):2195-2207)。2011年，李昊剑等以枯草芽胞杆菌W168为出发菌株，通过敲除purA基因和deoD基因构建得到一株肌苷工程菌，发酵72h，肌苷产量达到了7.6g/L(Li,H.,et al.2011.De novo engineering andmetabolic flux analysis of inosine biosynthesis in Bacillus subtilis.Biotechnology Letters 33.8:1575-1580)。以上代谢工程改造涉及了肌苷代谢网络的前体合成途径、分支代谢途径和分解代谢途径等多个方面，但肌苷最高产量仅为7.6g/L，与实现工业化应用存在较大差距。

阻断肌苷分解途径是肌苷生产菌株构建的策略之一。嘌呤核苷磷酸化酶能将肌苷分解为核糖1-磷酸和次黄嘌呤。肌苷发酵中常用的枯草芽胞杆菌中存在两种嘌呤核苷磷酸化酶，分别由deoD和pupG(又称punA)基因编码。这两种酶的底物偏好性有所不同：deoD编码的嘌呤核苷磷酸化酶主要以腺苷为底物，而pupG编码的嘌呤核苷磷酸化酶主要以肌苷、鸟苷和黄苷为底物。本发明人前期的研究结果证实在purA缺失基础上单独敲除pupG基因的菌株仍具有部分的肌苷分解活性，而在此基础上敲除deoD基因会导致菌株生长缓慢，导致菌株的肌苷产量下降。

发明内容