[发明专利]检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测多菌灵的酶联免疫试剂盒及其应用，可定性、定量检测烟叶中多菌灵药物的残留量。

背景技术

我国是生产和使用化学农药的大国，长期使用农药对生态环境以及人体健康的危害和影响已经引起人们的高度关注。多菌灵[carbendazim，N-(2-苯并吡唑基)氨基甲酸甲酯]为苯并吡唑类，是一种良好的广谱、内吸性杀菌剂，对子囊菌、担子菌以及半知菌类中的大多数病原菌都有效，广泛应用于农作物以及中草药的病害防治工作中。多菌灵化学性质稳定，能被植物的种子、根和叶吸收，残效期较长，对人、畜均有一定毒性，可引起抽搐、精神恍惚、恶心呕吐、胸闷、头晕等中毒症状。因此，有关多菌灵残留量的分析已经越来越受到重视。

由于多菌灵在农作物病害的防治方面有着广泛的应用，但其对人体又有一定的毒害性，目前世界许多国家都制定了多菌灵在不同种(类)农副产品中残留量的最高限量标准。加拿大国家标准规定黄瓜、西葫芦等蔬菜中多菌灵残留量每公斤不得超过0.5 mg；马来西亚规定蔬菜类中多菌灵残留量每公斤不得超过1 mg；我国卫生标准GB14870294中规定蔬菜、水果中多菌灵残留量每公斤不得超过0.5 mg。但目前尚无简单、快捷的检测方法。

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术状况而提供一种能够检测烟叶中多菌灵药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法，应用本发明的酶联免疫法测定烟叶中多菌灵药物的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、多菌灵标准品溶液、多菌灵抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为多菌灵偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的多菌灵抗抗体，所述多菌灵偶联抗原是由多菌灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述多菌灵半抗原是由多菌灵和三氟乙酸酐、硝酸铵反应得到。

所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白。

所述多菌灵半抗原分子结构式为：

。

所述多菌灵抗体是以多菌灵偶联抗原作为免疫原制备获得，所述多菌灵抗体为多菌灵单克隆抗体或多菌灵多克隆抗体，其中优选多菌灵单克隆抗体。

所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标二抗是由酶和多菌灵抗抗体偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括多菌灵标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述多菌灵标准品溶液6瓶，浓度分别为0 µg/L、0.1 µg/L，0.3 µg/L，0.9 µg/L，2.7 µg/L，8.1 µg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2 mol/L的硫酸溶液或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1~2 mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01‰~0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1~0.3 mol/L的磷酸盐缓冲液，其中的百分比为重量体积百分比，单位g/mL。

所述复溶液优选为pH值为7.0、0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1~7.5，含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0.1~0.3 mol/L的磷酸盐缓冲液。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20 μg/mL，每孔加入100 μL，25℃避光孵育2 h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入150~200 μL封闭液，25℃避光孵育1~2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的多菌灵和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗多菌灵的酶标二抗，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含残留物多菌灵的含量成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中多菌灵的残留量。