[发明专利]人工肝细胞微流体微囊制备方法及其微流体微囊发生装置

说明书

本发明涉及组织工程和实验室设备技术领域，特别涉及一种人工肝细胞微流体微囊制备方法及其该方法的专用设备—一种微流体微囊发生装置。本发明利用海藻酸钠与氯化钙反应生成海藻酸钙水凝胶的化学原理，通过设计微流体装置，借助连续相液体对分散相液体的剪切力、表面张力等作用形成大小稳定的微囊。本发明制备得到的人工肝细胞微囊，能较长时间的维持囊内种子细胞功能，在体外肝衰竭类似血浆影响下和体内炎症因素作用下依然能代谢有害物质，保持一定的肝功能，有望应用于生物人工肝系统和细胞治疗。

技术领域

本发明涉及组织工程和实验室设备技术领域，特别涉及一种人工肝细胞微流体微囊制备方法及其―种微流体微囊发生装置。

背景技术

肝衰竭是常见的危重疾病，病情复杂，死亡率高。肝移植是治疗肝衰竭较为有效的方法，但临床上供体肝来源严重缺乏，很多患者在等待移植的过程中死亡。因此急需发明一种切实有效的生物人工肝支持系统，来暂代肝脏功能，给患者自身肝脏恢复创造一个良好的环境，或帮助患者顺利过渡到移植手术期。生物人工肝支持系统中最核心的部分是种子细胞，该细胞能代替肝脏行使代谢、解毒、合成等功能，最理想的就是原代自体肝细胞，然而到肝病终末期，患者自体肝细胞状态往往很差，难以胜任此工作。国内外研究较多的种子细胞有原代猪肝细胞、功能改进后的人肝癌细胞株、IPS类肝细胞和原代异体肝细胞等。常用的二维细胞培养模式很难维持这些细胞的功能。

微囊化细胞培养技术是利用生物兼容性高分子材料形成微囊将细胞包裹在其中实现三维培养的一种技术，形成的微囊可以阻绝免疫细胞及大分子抗体进入囊内，同时允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入，能较好的保护囊内细胞维持细胞活性及功能。有学者将微囊化原代猪肝细胞应用于生物人工肝研究，取得了一定的成效。然而，常用的依靠高速气流(Sugiura S，Oda T，Aoyagi Y，et a1..Microfabricatedairflow nozzle for microencapsulation of living cells into 150 micrometermicrocapsules[J].Biomed Microdevices，2007，9：91—99)、高压静电(Willaert R G,Baron G V.Gel entrapment and micro—encapsulation：methods,applications andengineering principles[J].Rev Chem Eng.,1996,12:185-205)等微囊发生装置难以得到大小稳定的微囊，且制作成本高，制作过程容易对细胞造成损伤。

微流体技术是指采用微细加工技术制作出微通道网络结构，或者将各种微细管道把实验室大型设备集成在尽可能小的操作平台上，用以完成不同实验的技术。近些年来，该技术在化学、生物学等领域得到广泛应用，它不仅使试剂的消耗降低，而且使实验速度提高，费用降低，充分体现了当今实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势(林炳承,秦建华.微流控芯片分析化学实验室[J].高等学校化学学报,2009,03:433-445)。因此，开发基于微流体的微囊发生装置将简化实验步骤，缩小实验设备，精确控制微囊大小，减小微囊制作过程对细胞造成伤害。

海藻酸钠凝胶因具有生物相容性好、细胞毒性较低、无免疫原性、可被生物降解、可以在适宜的条件下加工成形等优点，正被广泛应用于制作生物医学领域的微囊，例如甲状腺细胞、胰岛细胞、肝细胞的包囊(Prakash S.Artificial cell therapy：Newstrategies for the therapeutic delivery of live bacteria[J].Journal ofBiomedicine and Biotechnology,2005，44—56)。单纯的海藻酸钠微囊化肝细胞，较传统的二维细胞培养模式能更好的维持肝细胞功能。但由于肝细胞生长的特殊性，例如贴壁生长、需要胶原支撑等，单纯的海藻酸钠微囊尚无法长时间维持其功能，离应用于生物人工肝系统还有一段距离。

发明内容